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除虫菊（Tanacetum cinerariifolium,syn.Chrysanthemum cinerariifolium）为菊科多年生草本植物,兼具观赏植物和经济作物多重用途,尤其以产生安全无毒,环境友好的天然杀虫剂除虫菊酯而著称,其天然产品供不应求。除虫菊目前的研究多集中在除虫菊酯产品的提取工艺上,而除虫菊植物中的除虫菊酯合成代谢途径及相关基因功能的研究尚不清楚。菊基二磷酸合成酶基因（Chrysanthemyl Diphosphate Synthase,CDS gene）是除虫菊酯合成路径中的第一个关键前体基因,能催化两分子的二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）的环己烷反应生成菊基二磷酸（CPP）。在本研究中,我们从除虫菊重新分离得到TcCDS基因（Accession number:JX913537）,纠正了其编码区前8个氨基酸的起始位点,其余部分与前人报道的TcCDS基因（Accession number:I13995）一致,将其重新命名为TcCHS基因（Chrysanthemol Synthase,菊基醇合成酶基因）,并分别从蛋白酶功能,组织定位,催化活性机理等方面对TcCHS基因进行了相关的研究。主要研究结果如下:1.解析了TcCHS基因编码的双重蛋白酶催化机制。通过体外表达证实,TcCHS不仅能催化DMAPP生成CPP,同时也能进一步催化水解CPP合成下游单萜菊基醇COH。TcCHS同时具备异戊烯基转移酶和萜类合成酶的双重蛋白酶功能。进一步点突变试验证实,其氨基酸序列中负责类异戊二稀代谢催化功能的第二个保守域位点NDXXD决定了此双重酶活性。2.首次揭示了TcCHS基因转化菊花产生菊基醇及其糖苷的双重抗蚜防御机制。将TcCHS基因转化蚜虫高感型菊花‘1581’品种,植株表型未发生显著变化,但是检测到转基因植株产生了新的菊基醇挥发物和糖苷态内含物。蚜虫双向选择试验表明,菊基醇挥发物与菊基醇丙二酰糖苷内含物均对棉蚜具有生物活性。通过蚜虫繁殖试验以及蚜虫刺吸电位技术（EPG）试验表明,TcCHS转基因菊花植株能明显降低蚜虫的繁殖率并影响蚜虫的刺吸行为。开放条件下的蚜虫自然感染试验也证实转基因植株具有很强的抗蚜性。该基因的表达诱导了以菊基醇气味排斥性与菊基醇糖苷阻食性结合的双重防御系统,这也为植物抗蚜工程从萜类代谢途径提供了新的思路。3.克隆并验证了除虫菊TcCHS腺体特异型启动子。从除虫菊腺体克隆到1128bp的TcCHS启动子片段,其序列包含一系列与激素、光信号和生物与非生物胁迫相关的顺式元件。将TcCHS启动子连接报告基因GFP转化菊花,转基因植株中GFP仅在叶片和茎段的腺体组织表达,表明除虫菊TcCHS启动子属于腺体特异型启动子。通过启动子缺失片段瞬时转化烟草,进一步确定了启动子的核心活性区域。同时,利用激素茉莉酸甲酯Me JA处理转TcCHS启动子菊花,结果表明Me JA能在12 h之内诱导TcCHS启动子的表达。同时,处理野生型除虫菊植株也能诱导除虫菊中除虫菊酯含量的提高以及除虫菊幼苗腺体密度的增加。这一试验为研究该基因表达与除虫菊酯关系提供了基础,且为进行腺体特异性表达的萜类代谢工程提供依据。4.分离并鉴定除虫菊首个质体倍半萜合成酶FAS基因。在克隆除虫菊TcCHS基因的同时,从除虫菊和菊花中克隆得到另外6个同源基因,根据序列同源比对分为2个CHS-like基因以及4个FDS-like基因。CHS-like基因与TcCHS基因具有较高的氨基酸相似性以及在除虫菊中相同的基因表达模式。CHS-like基因同样定位于质体,其在植物体内外能优先催化DMAPP和IPP产生法尼醇FOH,同时也能水解不同的异戊烯基二磷酸（GPP、FPP和CPP）生成相应的萜类,将其命名为FAS基因。试验证明,该基因同样具有异戊烯基转移酶和萜类合成酶的双重蛋白酶活性,同时也是除虫菊中克隆得到的第一个质体倍半萜合成酶。5.初步解析了TcCHS蛋白在植物体内外的催化机理。前期试验表明,TcCHS蛋白虽然能在体外催化产生下游产物菊基醇,但是其在植物体外催化活性很低,而在大肠杆菌菌体以及菊花与烟草体内具有较高的催化活性。我们克隆了烟草Ni GGDS基因以及除虫菊Tc GGDS基因,通过添加TcCHS和Ni GGDS不同的纯化蛋白酶组合进行体外酶活性反应以及双分子荧光杂交试验证实,GGDS蛋白能与TcCHS蛋白在植物体内互作形成异质二聚体形态从而提高TcCHS的催化活性。这也为研究植物萜类合成酶在植物体内的催化机理提供了一定的理论基础。综上所述,本研究首次揭示了TcCHS基因及其同源基因的双重酶催化功能及其抗虫分子生态,并初步探索了TcCHS基因在植物体内的催化活性机理,首次从除虫菊鉴定了第一个腺体特异型启动子。这些成果为研究鉴定除虫菊酯合成代谢途径上的其他基因以及植物萜类合成的催化机理提供了一定的理论基础,也对以提高除虫菊酯含量为目的的除虫菊分子育种以及通过基因工程改良菊花等花卉植物的抗虫性提供了实践指导,具有良好的产业环保意义。