苏云金芽胞杆菌是一种能形成芽胞的革兰氏阳性细菌，其主要特征是芽胞形成的同时伴有晶体的形成。对于大多数苏云金芽胞杆菌，晶体产生于芽胞外壁外，靠近母细胞一侧，当芽胞成熟、母细胞裂解后，形成游离的晶体。而少数亚种（如本研究所涉及的幕虫亚种菌株YBT-020）晶体形成于芽胞外壁内侧，当芽胞成熟母细胞裂解后晶体和芽胞不分离，形成粘连的晶体，这种特异的表型被称为晶胞粘连（Spore-Crystal-Association, SCA）。　　通过筛选 YBT-020的 BAC文库，利用片段互补实验，将决定晶胞粘连必须因子的基因分别定位于编码晶体蛋白的基因 cry26Aa，2个类晶体蛋白基因 scaA和 scaB及3个芽胞萌发受体相关基因 scaC-E上。前人给出了对于 YBT-020晶胞粘连机制的假设：Cry26Aa蛋白是晶胞粘连中粘连晶体的主要成分， ScaA和ScaB直接或间接地把 Cry26Aa晶体蛋白定位在芽胞衣上，随后被形成的芽胞外壁包裹，形成晶胞粘连表型。　　本研究开展了相关实验验证该假设：　　1.为观察芽胞形成的不同时期晶体与芽胞的位置关系，对野生型菌株 YBT-020和突变菌株 JA(scaA-B插入突变)进行电子显微镜观察。结果显示：A. YBT-020的芽胞外壁帽子结构先形成，晶体再在其内侧形成，而 JA的晶体形成于芽胞帽子结构外侧；B.YBT-020及其突变株 JA均是晶体形成大小基本不变时芽胞衣片层结构才开始形成。综上说明 YBT-020的晶胞粘连现象最初表现为晶体形成于帽子结构内侧，与芽胞衣或其组分无关。　　2.构建载体 cry26Aa-gfp-pHT304，转化YBT-020的 cry26Aa缺失突变株 J1，获得菌株BMB1904。利用激光共聚焦显微镜观察晶体蛋白的表达时空，结果表明晶体蛋白在芽胞形成隔膜后期就开始表达，均匀分布在细胞中，后逐渐聚集变大成一些小蛋白，然后慢慢变成大晶体蛋白。最终，当母细胞裂解，被标记荧光的Cry26Aa-GFP位于芽胞外壁内侧。　　3.我们也构建了关键基因 scaA和 scaB分别与 gfp融合表达载体scaA-gfp-pHT304及 scaA-scaB-gfp-pHT304并转化 scaA-scaB缺失突变株 JA，得到菌株 BMB1902及 BMB1903,观察融合蛋白表达时空。结果显示，BMB1902和BMB1903在初始细胞壁形成的早期开始产生荧光信号， ScaA-B-GFP的荧光聚集于芽胞外壁帽子结构附近，而 ScaA-GFP的荧光信号分散于芽胞中直至芽胞成熟。表明晶胞粘连必须因子 ScaA与 ScaB在帽子结构形成早期或接近其形成期表达，明显早于芽胞衣形成。因此，他们与芽胞衣无关，而与芽胞外壁帽子结构相关。　　4.由于scaA和scaB编码的蛋白与晶体蛋白 NT40KD和 NT32KD分别具有30％和22%序列一致性，我们怀疑这两个蛋白具有形成晶体蛋白的潜力。通过替换强启动子后，成功超表达这两个蛋白，镜检没发现晶体颗粒，表明YBT-020中的 ScaA和ScaB不能通过提高表达量形成晶体蛋白。　　5.载体pEMB0557，即 BAC60，是我室构建并保存用于大片段克隆的穿梭工具载体，在无抗性压力条件下，遗传稳定性较差，传100代后，50%菌株丢失该质粒。前期，在研究其装载片段大小与遗传稳定性关系时发现，其装载的片段越大，稳定性越低。而在使用 YBT-020来源的 pBMB28质粒片段时，意外的发现两个大片段625，30.0kb和721，48.8 kb，能够使 pEMB0557稳定的遗传，稳定性分别为传100代，100%和传100代，87%，明显不符合这一规律。为了研究是什么因子导致了这一现象，我们选定使 pEMB0557更稳定的片段625作为起点开展截短工作，寻找使之稳定的最小因子。　　通过亚克隆实验，625的一个10.3kb的 BamHI片段能够达到与625一样的稳定性。序列分析，这个10.3kb的片段主要由转座子上游的潜在的细菌素合成基因簇相关基因和下游的4kb片段组成。推测稳定因子更可能定位于下游的4kb片段上。通过PCR将该4kb片段装载到 pEMB0557上，结果能够使之稳定。通过设计引物，扩增包含不同 ORFs的片段，最终将稳定因子定位于一个包含 orf9的2023bp片段上。对其进行注释分析，发现其为一个编码 SprT-like family的蛋白，与已知的稳定性基因无关。而进一步分析，在这个序列中发现一些与分离位点 par位点同源的短的重复序列单元 TAATTGAATAA。我们推测它们可能能够弥补载体pEMB0557该片段数量的不足，从而互补其上不完整的 Ia型主动分配系统。