论文部分内容阅读
一、与冠心病易感性相关的基因多态性rs17514846对FURIN表达的影响及FURIN对内皮细胞行为的作用
背景与目的：
冠心病(coronary artery disease，CAD)是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因，其发病机制复杂，由环境因素和遗传因素共同参与。全基因组关联分析(Genome-wide association studies, GWAS)方法已发现163个与CAD关联的基因位点，其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)rs17514846位于第15号染色体的15q26.1区段，是GWAS发现的一个新的与CAD关联基因多态性位点。rs17514846位于编码FURIN基因的内含子1区域，其多态性(A/C)调节巨噬细胞FURINmRNA的表达水平，并影响CAD的易感性。FURIN，也称为PCSK3，是一种是Ca2+依赖的丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶(proprotein convertase, PC)家族，由FURIN基因所编码，是实现蛋白水解酶调节功能的关键因素，可激活某些酶类、激素、生长因子、受体、粘附蛋白、血浆蛋白等重要的生物蛋白。最近研究表明，FURIN通过影响单核巨噬细胞的行为参与动脉粥样硬化进展。另外，人的动脉粥样斑块内皮细胞内也探测到FURIN蛋白表达。然而，rs17514846是否会调控内皮细胞FURIN的表达而进而影响内皮细胞的行为尚不完全清楚，本研究旨在探讨rs17514846对内皮细胞FURIN表达的影响以及由此导致的内皮细胞行为的改变。
材料与方法：
我们从英国伦敦大学实验室获得自131个受试者脐静脉分离出来的脐静脉内皮细胞，分别从培养的脐静脉内皮细胞提取基因组DNA，用TaqMan探针法进行SNPrs17514846的基因分型；同时提取RNA，用实时定量PCR(Quantitative reverse-transcription polymerase-chain-reaction，qRT-PCR)技术测定内皮细胞FURIN基因表达水平。采用凝胶电泳迁移率分析方法检测rs17514846对核蛋白与DNA结合的影响；利用双荧光报告基因的方法检测rs17514846不同等位基因序列的转录活性。采用RNA干扰，即小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的方法抑制内皮细胞FURIN的表达，然后研究单核细胞-内皮细胞黏附/迁移的行为。用蛋白免疫印迹试验(Western blotting)检测内皮细胞FURIN、血管细胞粘附分子-1、细胞间黏附分子-1、内皮素-1以及单核细胞趋化蛋白-1的蛋白表达水平；用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)方法检测内皮细胞上清中内皮素-1的分泌和核蛋白核因子κB的表达水平。
结果：
Real-timePCR分析显示，在体外培养的血管内皮细胞上，FURIN表达在携带冠心病风险基因rs17514846的A等位基因的个体明显高于携带C等位基因的个体，双荧光素酶报告基因分析表明，rs17514846的风险等位基因A比非风险等位基因C具有更高的转录活性。利用内皮细胞核蛋白提取物进行凝胶电泳迁移率分析提示，SNPrs17514846与核蛋白结合具有等位基因效应，C等位基因具有更强的核蛋白亲和力。内皮细胞FURIN敲除能够抑制单核细胞-内皮细胞的黏附以及血管细胞粘附分子-1的表达；而且，内皮细胞FURIN敲除能够降低内皮素-1的分泌、减弱核蛋白核因子κB的活性、降低单核细胞趋化蛋白-1的表达，从而抑制单核细胞跨内皮细胞的迁移。
结论：
与CAD关联的15q26.1位点中的SNPrs17514846通过影响FURIN基因的转录从而影响了血管内皮细胞中FURIN的表达水平。内皮细胞中的FURIN水平影响单核细胞-内皮细胞的粘附和迁移行为。
二、昼夜节律调节相关基因变异rs3993105和rs1047354与冠心病易感性的关联研究
背景与目的：
昼夜节律(circadian)存在于各种各样的生物体中，是一种内在的分子计时机制。在哺乳动物中，昼夜节律系统由中枢时钟和外周时钟组成。哺乳动物的昼夜节律系统对于行为调节和生理节奏至关重要，例如，体温、睡眠-觉醒周期、新陈代谢和血压。近年研究提示昼夜节律可能参与动脉粥样硬化的发病机制，并可影响动脉粥样硬化过程中的多种细胞的功能变化。冠心病(coronary artery disease，CAD)是一种由环境因素和遗传因素共同参与的复杂疾病，其潜在机制是冠状动脉粥样硬化。全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)已经发现超过160个CAD相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)，其中包括ARNTL基因内含子上SNPrs3993105。ARNTL基因编码生物钟的调节蛋白ARNTL。rs1047354则位于CLOCK基因的内含子上，CLOCK基因可以编码生物钟的另外一个调节蛋白CLOCK。本研究目的在于探讨昼夜节律基因相关的SNPrs3993105及rs1047354是否与CAD存在关联性以及这两个SNPs是否影响急性心肌梗死患者的发病时间。
材料与方法：
我们收集来自汕头大学医学院第一附属医院心内科行冠脉造影检查患者的血液样本，提取DNA后用TaqMan探针法行SNPrs3993105基因分型；提取RNA后用实时定量PCR技术测定ARNTL基因表达水平。收集因急性心肌梗死入住汕头大学医学院第二附属医院冠心病监护病房的患者血液样本，提取DNA并用TaqMan探针法进行SNPrs3993105和rs1047354的基因分型。收集来自汕头大学医学院第二附属医院冠心病监护病房的4例急性心肌梗死患者血液样本进行全血细胞培养，然后在不同时间点(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、48h)收集培养的全血细胞，提取RNA后用实时定量PCR技术测定ARNTL和CLOCK基因表达水平。
结果：
TaqMan探针的基因分型结果未发现SNPrs3993105与冠心病易感性的关联关系，也未发现SNPrs3993105影响ARNLT的基因表达水平。随后的亚组分析也未发现SNPrs3993105与CAD患者是发生心肌梗死存在关联关系。其次，在对急性心肌梗死患者发病时间的关系的研究中，发现在年龄≤60岁患者当中，SNPrs1047354的AA基因型患者更倾向于在12:00-24:00发病，而GG基因型患者更倾向于在0：00-12:00发病。而未发现SNPrs3993105和患者发病时间有类似相关关系。另外，我们还发现心肌梗死合并糖尿病更倾向于在12:00-24:00发病，而这个似乎与SNPrs3993105和rs1047354的基因型无关。最后，在急性心肌梗死患者的血液全血培养中，并未发现4个患者ARNTL和CLOCKmRNA表达水平存在同步的昼夜节律。
结论：
CLOCK基因多态性rs1047354和患糖尿病可能会影响急性心肌梗死患者的发病时间，而本研究并未发现ARNTL基因相关的SNPrs3993105与CAD存在关联关系。
背景与目的：
冠心病(coronary artery disease，CAD)是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因，其发病机制复杂，由环境因素和遗传因素共同参与。全基因组关联分析(Genome-wide association studies, GWAS)方法已发现163个与CAD关联的基因位点，其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)rs17514846位于第15号染色体的15q26.1区段，是GWAS发现的一个新的与CAD关联基因多态性位点。rs17514846位于编码FURIN基因的内含子1区域，其多态性(A/C)调节巨噬细胞FURINmRNA的表达水平，并影响CAD的易感性。FURIN，也称为PCSK3，是一种是Ca2+依赖的丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶(proprotein convertase, PC)家族，由FURIN基因所编码，是实现蛋白水解酶调节功能的关键因素，可激活某些酶类、激素、生长因子、受体、粘附蛋白、血浆蛋白等重要的生物蛋白。最近研究表明，FURIN通过影响单核巨噬细胞的行为参与动脉粥样硬化进展。另外，人的动脉粥样斑块内皮细胞内也探测到FURIN蛋白表达。然而，rs17514846是否会调控内皮细胞FURIN的表达而进而影响内皮细胞的行为尚不完全清楚，本研究旨在探讨rs17514846对内皮细胞FURIN表达的影响以及由此导致的内皮细胞行为的改变。
材料与方法：
我们从英国伦敦大学实验室获得自131个受试者脐静脉分离出来的脐静脉内皮细胞，分别从培养的脐静脉内皮细胞提取基因组DNA，用TaqMan探针法进行SNPrs17514846的基因分型；同时提取RNA，用实时定量PCR(Quantitative reverse-transcription polymerase-chain-reaction，qRT-PCR)技术测定内皮细胞FURIN基因表达水平。采用凝胶电泳迁移率分析方法检测rs17514846对核蛋白与DNA结合的影响；利用双荧光报告基因的方法检测rs17514846不同等位基因序列的转录活性。采用RNA干扰，即小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的方法抑制内皮细胞FURIN的表达，然后研究单核细胞-内皮细胞黏附/迁移的行为。用蛋白免疫印迹试验(Western blotting)检测内皮细胞FURIN、血管细胞粘附分子-1、细胞间黏附分子-1、内皮素-1以及单核细胞趋化蛋白-1的蛋白表达水平；用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)方法检测内皮细胞上清中内皮素-1的分泌和核蛋白核因子κB的表达水平。
结果：
Real-timePCR分析显示，在体外培养的血管内皮细胞上，FURIN表达在携带冠心病风险基因rs17514846的A等位基因的个体明显高于携带C等位基因的个体，双荧光素酶报告基因分析表明，rs17514846的风险等位基因A比非风险等位基因C具有更高的转录活性。利用内皮细胞核蛋白提取物进行凝胶电泳迁移率分析提示，SNPrs17514846与核蛋白结合具有等位基因效应，C等位基因具有更强的核蛋白亲和力。内皮细胞FURIN敲除能够抑制单核细胞-内皮细胞的黏附以及血管细胞粘附分子-1的表达；而且，内皮细胞FURIN敲除能够降低内皮素-1的分泌、减弱核蛋白核因子κB的活性、降低单核细胞趋化蛋白-1的表达，从而抑制单核细胞跨内皮细胞的迁移。
结论：
与CAD关联的15q26.1位点中的SNPrs17514846通过影响FURIN基因的转录从而影响了血管内皮细胞中FURIN的表达水平。内皮细胞中的FURIN水平影响单核细胞-内皮细胞的粘附和迁移行为。
二、昼夜节律调节相关基因变异rs3993105和rs1047354与冠心病易感性的关联研究
背景与目的：
昼夜节律(circadian)存在于各种各样的生物体中，是一种内在的分子计时机制。在哺乳动物中，昼夜节律系统由中枢时钟和外周时钟组成。哺乳动物的昼夜节律系统对于行为调节和生理节奏至关重要，例如，体温、睡眠-觉醒周期、新陈代谢和血压。近年研究提示昼夜节律可能参与动脉粥样硬化的发病机制，并可影响动脉粥样硬化过程中的多种细胞的功能变化。冠心病(coronary artery disease，CAD)是一种由环境因素和遗传因素共同参与的复杂疾病，其潜在机制是冠状动脉粥样硬化。全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)已经发现超过160个CAD相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)，其中包括ARNTL基因内含子上SNPrs3993105。ARNTL基因编码生物钟的调节蛋白ARNTL。rs1047354则位于CLOCK基因的内含子上，CLOCK基因可以编码生物钟的另外一个调节蛋白CLOCK。本研究目的在于探讨昼夜节律基因相关的SNPrs3993105及rs1047354是否与CAD存在关联性以及这两个SNPs是否影响急性心肌梗死患者的发病时间。
材料与方法：
我们收集来自汕头大学医学院第一附属医院心内科行冠脉造影检查患者的血液样本，提取DNA后用TaqMan探针法行SNPrs3993105基因分型；提取RNA后用实时定量PCR技术测定ARNTL基因表达水平。收集因急性心肌梗死入住汕头大学医学院第二附属医院冠心病监护病房的患者血液样本，提取DNA并用TaqMan探针法进行SNPrs3993105和rs1047354的基因分型。收集来自汕头大学医学院第二附属医院冠心病监护病房的4例急性心肌梗死患者血液样本进行全血细胞培养，然后在不同时间点(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、48h)收集培养的全血细胞，提取RNA后用实时定量PCR技术测定ARNTL和CLOCK基因表达水平。
结果：
TaqMan探针的基因分型结果未发现SNPrs3993105与冠心病易感性的关联关系，也未发现SNPrs3993105影响ARNLT的基因表达水平。随后的亚组分析也未发现SNPrs3993105与CAD患者是发生心肌梗死存在关联关系。其次，在对急性心肌梗死患者发病时间的关系的研究中，发现在年龄≤60岁患者当中，SNPrs1047354的AA基因型患者更倾向于在12:00-24:00发病，而GG基因型患者更倾向于在0：00-12:00发病。而未发现SNPrs3993105和患者发病时间有类似相关关系。另外，我们还发现心肌梗死合并糖尿病更倾向于在12:00-24:00发病，而这个似乎与SNPrs3993105和rs1047354的基因型无关。最后，在急性心肌梗死患者的血液全血培养中，并未发现4个患者ARNTL和CLOCKmRNA表达水平存在同步的昼夜节律。
结论：
CLOCK基因多态性rs1047354和患糖尿病可能会影响急性心肌梗死患者的发病时间，而本研究并未发现ARNTL基因相关的SNPrs3993105与CAD存在关联关系。