目的 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC_s)又称为骨髓基质细胞，是存在于成年骨髓中的一种干细胞。它不仅可诱导分化为中胚层来源的各种细胞，还可以分化为神经胶质细胞和神经元样细胞。骨髓间充质干细胞取材方便，扩增迅速，可通过血脑屏障在脑内广泛迁移，无免疫排斥反应。这使其成为神经系统疾病细胞移植治疗的合适的供体细胞。 目前，国内关于骨髓间充质干细胞在神经系统疾病应用方面的研究还很少见。本文旨在建立一种稳定可靠的成年小鼠骨髓间充质干细胞的培养及诱导分化为神经元样细胞的方法，为进一步的研究奠定基础。 实验方法 1．6～8周成年昆明小鼠，无菌条件下取双侧股骨，获取骨髓细胞，通过弃去未贴壁的细胞，可分离获取MSC_s进行培养。倒置相差显微镜每日观察原代、传代细胞的形态变化，生长状态。HE染色观察细胞形态。 2．采用含有1mmol／L β巯基乙醇，10％胎牛血清的DMEM培养液预诱导MSC_s24h，再用含8mmol／L β巯基乙醇无血清的DMEM培养液诱导6h，倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态变化，免疫组化测定诱导前后神经元特异性烯醇化酶(NSE)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达，记数诱导前后阳性细胞数，诱导后NSE中等强度阳性和强阳性的细胞数，计算均值和标准差。 3．为证明培养的细胞具有多向分化潜能，采用含 IX 10一mol／L地塞米松、10％胎牛血清的 DMEM培养液诱导 MSC＊2天，油红O染色以鉴定脂肪细胞形成。 结 果 1．培养细胞各代形态稳定，以成纤维状细胞为主。前五代细胞7－9天可达到融合。 2．pat基乙醇诱导后MSCs形态变化明显，胞体收缩成锥形、球形，突起增多。免疫组化染色未诱导的MSCs大部分细胞NSE成微弱的阳性表达，少数细胞为阴性。诱导后NSE表达明显增高，中等强度阳性和强阳性的细胞数占细胞总数的百分比为71．4ill．l％。诱导前后都未发现 GFAP阳性细胞。 3．地塞米松诱导12天后油红O染色，可见含红色脂滴的脂肪细胞。未诱导的MSCs油红O染色为阴性。 讨 论 至今还没有用于鉴定骨髓间充质干细胞的特异性标志物。通常的鉴定方法是通过其易于贴壁生长的性质，反复换液奔去未贴壁的造血细胞，使其得以纯化，形态学上观察细胞以成纤维样细胞为主，并具有多向分化潜能。我们培养的细胞遵循经典的培养方法，具有典型的形态特点，并证明其可以同时向神经元样细胞及脂肪细胞分化。所以说，我们所培养的细胞即为骨髓间充质干细胞。 实验中我们采用了最简单的接种方法，骨髓直接稀释法，即将所取细胞直接接种于培养瓶内。这样既提高了接种数量，又减 ·2·少了污染机会以及对细胞的损伤与破坏，提高了原代培养的成功率。 我们观察到MSCS可分为三类：一类是大而扁平的细胞，一类是较小的梭形细胞，在对数生长期初期还大量存在一种具有高度折光性的小圆形细胞。这与David等人的看法相一致。David等人用流式细胞仪分析后认为，这种小圆形细胞在对数生长期转化为成熟的MSCS细胞。而且，将小圆形细胞和成熟的MSCS细胞分别培养，小圆形细胞表现出更强的分化潜能。 NSE（神经元特异性烯醇化酶）和 GFAP（胶质纤维酸性蛋白）分另是神经元和神经胶质细胞的特异性的标志物。p流基乙醇诱导后NSE表达明显升高，而诱导前后都没有检测到GFAP的表达，这说明我们的诱导方法仅使MSCS向神经元样细胞分化。这与WOOdbmp等人的实验结果一致。由于我们没有证明诱导分化后的细胞有神经元的功能活动，我们仅称之为神经元样细胞。诱导后的细胞是否具有功能活动需要进一步研究。 尽管骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的机理目前还不清楚，骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病缺血性脑血管病、帕金森、创伤性脑损伤、坐骨神经再生，在动物实验中取得了明显的疗效。而且，Dezawa等人发现，将MSCs细胞体外诱导为具有Schwann细胞特点的细胞，再将其移人截断的坐骨神经末端，移植诱导后细胞的坐骨神经再生更显著，与移植未诱导MSCS组相比有显著性意义。那么，是否诱导分化为神经元样细胞的MSCS移植会更有助于中枢神经系统疾病的恢复值得继续研究。 结 论 1．在本实验培养条件下，原代接种成活率高，生长稳定， ·3·增殖迅速，培养细胞形态以成纤维样细胞为主，并具有多向分化潜能，培养细胞即为骨髓间充质于细胞。 2．pat基乙醇可诱导骨髓间充质于细胞体外分化为神经元样细胞，但不能诱导其分化为星形胶质细胞。