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目的:CRP(C-反应蛋白)是肝脏合成的一种与炎症有关的急性时相蛋白,是最敏感的炎症指标之一,健康人血液中的含量甚微(<3mg/L),当机体处于炎症或组织损伤时,血液中的CRP水平在数小时内急剧增高,最高可达正常水平的千倍(1000mg/L)以上。当炎症缓解时,CRP水平也随着病情好转逐渐下降,恢复至正常水平。
根据Pathologic Basis of Disease的标准,炎症是指“各种内源性和外源性刺激引起的细胞和组织的损伤,同时伴有血管反应的结缔组织的复合性反应”。本研究旨在通过检测不同类型炎症中CRP异常升高水平的差异,CRP异常升高持续时间的差异,及达CRP的峰值时人数构成的差异,来探讨CRP在感染性炎症(病原微生物直接感染所致)与非感染性炎症(指与超敏反应有关的炎症和自身免疫性炎症)中升高的特点,为揭示炎症的发生和演变规律及临床治疗提供理论依据;通过检测不同CRP基因型人群CRP升高水平的差异,来探讨基因在CRP升高方面所起的作用。
方法:选取唐山工人医院2002年1月1日-2004年12月31日3年间收治的患有感染性炎症(其中急性扁挑体炎22例;急性肺炎支气管炎51例;慢性支气管炎16例;肾盂肾炎5例;脑膜炎4例;肠炎12例)以及免疫性炎症(其中类风湿性关节炎8例;皮肌炎5例;干燥综合征4例;变应性亚败血症29例;过敏性紫癜33例;系统性红斑狼疮9例;肾小球肾炎16例;慢性肾小球肾炎6例)的病人二组。每组各110例,各组男:女为1:1,年龄14-82岁。健康对照组80例,男:女为1:1,年龄12-75岁。所有研究对象均为汉族,无血缘关系。利用免疫比浊法检测两组炎症患者血清中高敏CRP含量。应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)核苷酸分型技术检测两组炎症患者与健康对照组C-反应蛋白(CRP)的1059 G/C基因多态性,获得结果,操作过程如下:抽取外周静脉血5ml,枸橼酸钠抗凝:采用低渗溶血法获得白细胞,以常规酚/氯仿抽提法提取DNA,TE溶解保存。然后应用聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增。应用的引物(北京赛百盛基因技术有限公司),序列如下:上游引物5’-GAT CTG TGT GTG ATC TGA GAA ACC TCT-3,下游引物5’-GAG GTA CCA GAG ACA GAG ACG TG-3’PCR反应体系50ul,基因组DNA 100ng,10*PCR缓冲液5ul, 1 ul dNTP,3单位TaqDNA聚合酶(北京赛百盛基因技术有限公司)PCR反应条件:变性94℃2.5min:循环:94℃45 sec,56℃1min, 72℃1.5min,共35个循环:延伸72℃5min。取纯化后PCR产物20ul,限制性内切酶MaeⅢ(Roche Diagnostics,Germany)酶切,54℃水浴4h,酶切片段经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后通过UV凝胶成像系统判定结果。
统计学处理:对获得数据进行整理,核实,应用SPSS10.0软件分析。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计,验证研究对象符合Hardy-weinberg平衡的程度。对于CRP浓度(mg/L),因其为非正态分布,须先进行对数转换,变为近似正态分布,表示方法为X<,In CRP>±S±S<,In CRP>。根据资料性质和数据特点,采用t检验或X<2>检验。以P<0.05为有统计学意义。
结果:
1.炎症组人群CRP比较:
入院时感染性炎症组CRP升高比率为88.18%,CRP值为13.15mg/L(几何均值)(正常参考值0-2.6mg/L);入院时免疫性炎症组CRP升高比率为91.82%。CRP值为26.93 mg/L(几何均值)。两组比较(1nCRP)有显著差异(P<0.01)。两组炎症患者CRP异常升高持续时间:感染性炎症者CRP升高持续时间为9.92天(均值,下同),其中入院1周CRP为4.93mg/L(几何均值)(正常参考值0-2.6mg/L);入院2周为1.20mg/L;免疫性炎症者为19.92天,其中入院1周CRP为18.16mg/L;入院2周为9.75 mg/L;两组比较(1nCRP)有显著差异(P<0.01)。
2.两组炎症患者CRF,异常升高达峰值时间的构成比较:
感染性炎症者6小时内21例(19.1%)48小时内100例(90.9%)。免疫性炎症者6小时内11例(10.0%)48小时内83例(75.5%)。两组比较有显著差异(P<0.01)。
3.CRP基因型比较:
三组人群CRP各基因型分布:根据限制性内切酶Mae Ⅲ酶切结果GG型(310bp;233bp;201bp)者占77.50%-80.00%;GC型(434bp;310bp;233bp;201bp)+CC型(434bp;310bp)者占20.00%-22.5%;两组炎症患者CRP基因型及等位基因分布比较无显著差别,与对照组比较亦无显著差别(P>0.05)。
4.三种基因型人群CRP水平比较:
GG型CRP均值23.21 mg/L,GC型14.07 mg/L,CC型10.24 mg/L,GG与GC,GG与CC型间比较(1nCRP)有显著差别(P<0.01或P<0.05);而GC与CC型比较(lnCRP)未见显著差别(P>0.05)。
结论:免疫性炎症者CRP升高水平及持续时间均高于感染性炎症,大多数(75.5%-90.9%)的炎症患者CRP于入院后48小时内达到峰值。感染性炎症组多于2周内恢复至正常水平,而免疫性炎症者CRP异常增高多持续2周以上。而二种炎症患者与正常对照组人群CRP1059 G/C基因型与等位基因分布无差异。不同基因型者间CRP升高水平比较:GG基因型者CRP水平高于GC、CC型者,有显著差别。G等位基因表达可能高于C等位基因表达。