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本研究课题利用生物工程技术合成了新型重组α型IFN-α(122Arg),并对其生物活性进行了检测。 新型重组α型IFN基因的克隆:根据全长DNA序列,设计大致相等的8个片段,正、反向链各4个。其中F1-F4为正向链;R1-R4为反向链,与设计序列相应片段互补。利用美国ABI公司生产的自动DNA合成仪进行合成。将PCR扩增产物与pUC18进行双酶切后构建克隆载体,并转化至大肠杆菌,经蓝白斑筛选,提取质粒,测定插入的DNA序列表明,与设计目标一致。 新型重组α型IFN基因在大肠杆菌中的表达:构建表达载体质粒,将含全合成的人新型重组α干扰素基因片段的pUC18重组质粒用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,与pBV220连接后,转化至大肠杆菌,42℃热诱导表达目的蛋白。结果显示,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过超声破菌,抽提复性后以Sephacryl S-200HR分离获得目标蛋白。 新型重组α型IFN的生物活性检测:为研究其抗乙型肝炎病毒的作用,本试验在转染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15细胞中,研究了其对2.2.15细胞的毒性、HBsAg和HBeAg的分泌以及细胞培养液中HBV-DNA水平的影响。阳性对照药为美国安进公司生产的干复津。结果表明:新型重组α型IFN的半数中毒浓度(TC50)>10μg/ml。最大无毒浓度(>10μg/ml)与2.2.15细胞培养8天,对HBeAg和HBsAg的分泌具有一定的抑制作用。以斑点杂交法检测表明对细胞培养液的HBV-DNA水平有显著抑制作用。斑点杂交结果显示,干复津对细胞培养上清中的HBV-DNA水平也有抑制作用。新型重组α型IFN的抗病毒作用稍优于干复津。