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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为一种天然存在的非蛋白质氨基酸,具有多种重要的生理功能,在医药、食品、农业、畜牧业和化工领域应用广泛。通过益生性乳酸菌催化生产GABA已是人们目前普遍共识。然而,理解乳酸菌中GABA合成途径及其表达调控机制是强化乳酸菌作为细胞工厂高效生产该物质的前提。本文以课题组从鲜牛奶中分离得到的一株GABA高产菌株短乳杆菌(Lactobacillus brevis CGMCC 1306)为出发菌株,在解析其谷氨酸脱羧酶系统(GAD system)表达调控机制及关键蛋白催化特性,分析菌株GAD系统、FlFo-ATPase质子泵、胞内微环境及耐受酸胁迫之间关系的基础上,采用生理工程策略通过代谢工程与合成生物学手段强化乳酸菌GAD代谢途径、调控胞内微环境及细胞膜通透性,实现了高产工程菌株及混合发酵体系的构建与GABA的高效合成。主要结果如下:(1)建立了短乳杆菌遗传操作方法,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)和基于温敏性pGhost4系统的染色体无痕敲除技术等手段解析了Lb.brevis CGMCC 1306染色体上gad operon的转录表达调控机制,并探讨了GAD系统中关键蛋白在细胞抵御酸胁迫及GABA合成过程中的作用。研究表明:Lb.brevis CGMCC 1306含有两个谷氨酸脱羧酶基因,其中gadB与其上游的gadR及gadC连锁并以基因簇gadRCB形式存在于染色体上;gadA远离该基因簇单独出现在染色体上;gadC与gadB形成gadCB operon,共同转录和表达;gadR单独转录表达,并阳性调控gadCB operon的转录,为促进因子。gadCB operon所编码的蛋白是该菌株GAD活性的主要提供者,对细胞抵御酸胁迫起到了重要的作用。(2)建立了基于比色法的高GAD活性菌株高通量筛选方法,并成功获取了两株FlFo-ATPase活性弱化但GAD活性增强的Lb.brvis突变菌株。分析了FlFo-ATPase活性弱化菌株与对照菌株胞内微环境的差异,为理解GAD活性增强的原因和采用生理工程策略改造菌株提升GABA合成效率提供了理论支撑。结果显示:Lb.brvis的GABA合成过程与细胞内外pH、细胞膜FoFl-ATPase活性及菌株GAD系统关键蛋白催化性能之间存在着紧密关系。在适宜的酸胁迫条件下过量表达GAD系统关键蛋白并适当弱化FlFo-ATPase活性,能够有效促进Lb.brevis生产GABA的性能。其中,基于上述理论所获取的重组菌株Lb.brevis/pMG36e-gadA的FlFo-ATPase缺陷突变株Lb.brevis NRA6具有相对较高的GAD活性。控酸(pH 5.2)厌氧批次发酵条件下,该工程菌株在48 h内可累积GABA至43.65 g/L,转化率高达98.42%;为野生菌株的1.22倍。(3)通过筛选并理性改造来源于植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶(LpGadB),获得了 C-末端截短的但具有相对更宽泛催化pH范围的LpGadB突变体LpGadB△C11。在此基础上,基于生理工程策略合理组合GAD系统关键蛋白及突变体并强化其表达,有效促进了Lb.revis的GABA合成效率。其中,重组菌株Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC在分批补料发酵过程中,72 h可有效产生GABA高达104.38 g/L,为野生菌株的1.28倍。与此同时,采用上述策略并以乳酸菌模式菌株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis NZ9000)为出发菌株,进一步构建了目标菌株Lc.lactis NZ9000/pNZ8148-LpgadB△11-LcgadC,并考察了其GABA合成性能。自然发酵条件下,在含有60 g/LMSG的GM17发酵培养基中,36 h时该重组菌株GABA产量达18.94 g/L;而采用两阶段pH调控策略进一步有效增强了菌株GABA合成效率,发酵36 h时,GABA产量积累至30.89 g/L,为自然发酵条件下产量的1.63倍;而48 h发酵结束时,GABA产量高达32.16 g/L,转化率为87.92%,为目前基于乳酸乳球菌细胞批次发酵生产GABA所报道的最高水平。(4)通过合成生物学手段建立了基于温和型乳球菌噬菌体(lactococcal bacteriophage rlt)裂解盒(LytHA)与粪肠球菌(Ec.faecalis LMG 2333)细菌素(EnlA)的乳酸菌混合发酵体系中可控裂解平台工程菌株。实现了共培养体系中Lc.lactis细胞的可控裂解及Lb.brevis细胞膜的透性化,有效削弱了 GABA合成过程中Glu/GABA跨膜运输阻力,进一步提升了重组Lc.lactis及Lb.brevis细胞合成GABA的效率。在Lc.lactics NZ9000/pNZ8148-LcgadB与pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB的混合催化体系中,36 h时GABA浓度达37.64 g/L;而在 pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB与Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC 的混合发酵体系中,48 h后GABA产量高达126.85 g/L。