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米曲霉(Aspergillus oryzae)是酿造业中的重要微生物,对酱油、豆瓣、米酒等的产率和风味起着重要作用。然而生产实践中,米曲霉的生产能力常常欠佳,生长较快的菌种往往蛋白酶活力较低,而蛋白酶活力较高的往往生长速度较慢。另外,原生质体融合工作在丝状真菌中已有广泛开展,但传统方法中采用的利用营养缺陷标记亲本菌株一步工作相当繁琐,而且这些遗传标记还往往会干扰菌株的正常代谢,影响菌株的一些重要性状。由此,本实验采用了菌种GIM3.13和CICC2339的灭活原生质体作为遗传物质供体进行了原生质体融合,通过双亲本基因的随机整合使融合菌株集双亲优良遗传性状为一体。整个试验过程中,首先,对亲本米曲霉原生质体制备与再生中的破壁酶种类和浓度以及其它影响原生质体制备与再生的主要因素进行了研究,得到米曲霉原生质体制备与再生最佳条件组合为:纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶以5:3:1混合作为破壁酶,菌龄为15h,破壁时DTT加入量为3mM,0.8MNaCl溶液作为渗透压稳定剂。其次,是对原生质体灭活的研究,本试验对GIM3.13采用热灭活的方法,通过试验得到灭活最佳条件为灭活温度60℃,灭活时间15min,对CICC2339采用紫外线灭活,通过试验得到灭活最佳条件为15W紫外灯10cm处,照射5min。然后,对影响米曲霉灭活双亲本的融合主要条件因素进行了研究,得到融合佳条件组合为,35%的PEG6000加上0.02MCaCl2作为促融剂,pH值为7.5,融合时间为5分钟。最后融合子的成功筛选不仅表明灭活原生质体融合可应用于米曲霉,且经过初筛初步得到了产蛋白酶活力高且生长较快的米曲霉菌种。