青藏地区是重要的候鸟繁殖地和越冬地,每年约上万只候鸟在此停留。2005年5月,青海湖野鸟中暴发高致病性禽流感,导致上千只野鸟死亡,其中超过一半为斑头雁(Anser indicus),随后该病毒扩散至欧洲和非洲地区,且在接下来的几年中,该毒株在中亚迁徙路线的候鸟中被多次分离到,这使野鸟在禽流感传播中所起到的作用受到关注。除禽流感病毒外,斑头雁也可能携带病原细菌,对野生动物、家畜家禽以及人类的健康造成威胁。每年4~9月,有超过6000只斑头雁陆续迁徙至青海湖进行繁殖及育雏,频繁的个体间的接触可能会促进了病毒、细菌等病原在野鸟之间的水平传播。本研究于2013~2015年,采集青藏地区斑头雁组织器官及新鲜粪便累计1792份,首先采用RT-PCR试验进行禽流感病毒核酸的检测,然后对核酸检测为阳性的样品,采用SPF鸡胚进行病毒分离,最后对分离得到的禽流感病毒进行分子特征及遗传进化分析。同时,对2015年青海湖采集到的斑头雁粪便进行细菌的分离鉴定以及耐药性分析,探讨斑头雁粪便中携带细菌性病原的情况。主要研究结果如下:1.2013~2015斑头雁携带禽流感病毒检测与病毒的分离2013年、2014年、2015年分别在环青海湖湿地河口采集斑头雁粪便及组织样品124份、348份、860份,其中2015年在青海湖月牙湾采集死亡斑头雁幼鸟一只;2015年在西藏雅鲁藏布江流域采集斑头雁粪便460份。对样品进行禽流感病毒核酸检测,显示2013~2015年,青海湖斑头雁中禽流感病毒核酸的阳性检出率分别为0.72%(9/124)、5.7%(20/348)、18%(157/860);2015年,西藏雅鲁藏布江流域采集到的斑头雁粪便中,禽流感病毒核酸的阳性检出率是22%(101/460)。从2015年采集的死亡斑头雁幼鸟的肺部组织和3个斑头雁粪便样品中共分离到4株禽流感病毒H5N1,分别命名为A/bar-headed goose/Qinghai/F/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/47/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/Qinghai/70/2015(H5N1)、A/bar-headed goose/Qinghai/133/2015-(H5N1),简称QHL-F、QHL-47、QHL-70、QHL-133。2.禽流感病毒分子特征及遗传进化分析对2015年分离到的4株禽流感病毒进行全基因测序,并进行分子特征及遗传进化分析,结果表明,青海湖分离株QHL-F、QHL-47、QHL-70、QHL-133属于2.3.2.1c谱系,与2015年1月三门峡大天鹅疫情中分离到的毒株A/whooper swan/Henan/SMX1/2015(H5N1)各个基因片段均高度同源,且序列的一致性在99%~100%之间。对青海湖分离株进行遗传特征分析,发现其HA蛋白碱性裂解位点均含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的典型分子特征。HA蛋白138A、160A位点发生变异,突变用这种形式表示:S138A,表示有S突变为A,这可能会增强病毒结合哺乳动物受体的能力。NA茎部有20个氨基酸的缺失,这可能会增加病毒在哺乳动物中的致病力。此外,未发现其他与病毒致病性及耐药性相关的氨基酸位点发生变异。3.斑头雁粪便中细菌的分离鉴定从2015年采集的斑头雁粪便中挑选出30份进行细菌的分离鉴定。从30份斑头雁粪便中共分离到细菌123株,根据细菌在营养琼脂培养基中的形态特征以及革兰氏染色情况,将分离到的细菌分为10类,分别从每一类细菌中挑取一株细菌进行生理生化及分子生物学鉴定。结果显示这10株细菌分别为大肠埃希菌(Escherichia coli)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、枯草芽孢杆菌(Arthrobacter citreus)、柠檬节杆菌(Bacillus sublitis)、腐败希瓦氏菌(Shewanella pulrefaciens)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。选取氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星药敏纸片,对分离菌株进行耐药性分析,发现水生拉恩菌、杀鲑气单胞菌和成团泛菌表现为多重耐药性;其他细菌对氨苄西林和四环素有一定的耐药性,对其余受试药物都有不同程度的敏感性。