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目的:高同型半胱氨酸血症(HHcy)是心血管疾病的独立危险因素(CVD)。我们实验团队先前证明,同型半胱氨酸(Hcy)抑制血管内皮细胞(EC)细胞增殖、迁移和损伤后修复,但Hcy诱导的EC损伤分子机制尚不清楚。在这项研究中,我们发现了一种新的F-BAR蛋白Carom,可介导的Hcy诱导的EC迁移和血管生成抑制。方法:1、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹实验(WB)检测人动脉内皮细胞(HAEC),24h 50μm DL-Hcy刺激后,Carom m RNA和蛋白在内皮细胞的表达。2、高通量液相质谱法检测CBS KO小鼠同型半胱氨酸(Hcy)水平。WB检测CBS KO小鼠主动脉Carom的表达,WB及流式细胞仪技术(FACS)检测肺组织内皮细胞中Carom的表达。3、高通量液相质谱法检测HAEC Hcy、S-腺蛋氨酸(SAM)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水平,并计算SAM/SAH比例。用Actinnomyocin D及AZC处理内皮细胞,RT-PCR检测内皮细胞Carom。4、Adv-Carom病毒或Carom Sh-RNA病毒转染HAEC 72h,提取完整RNA,进行Carom相关的microarray及cytokine array。5、Adv-Carom病毒或Carom Sh-RNA病毒转染HAEC 72h,RT-PCR检测Carom及CXCL10 m RNA的表达水平。6、Hcy干预24h,Adv-Carom或Carom Sh-RNA病毒转染HAEC后72h,进行细胞划痕实验,观察Hcy和Carom对内皮细胞迁移功能的影响。同时加入CXCL10中和抗体,细胞划痕实验检测内皮细胞Carom和CXCLl0对细胞迁移功能的影响。7、Hcy干预细胞后,提取不同细胞成分的蛋白,WB鉴定Carom在细胞质,膜,细胞核及细胞骨架上表达变化。设计并合成Carom相关的NLS肽,内皮细胞同时给予Hcy和NLS肽处理后,WB检测Carom在染色质结合细胞核(CB)中的表达。内皮细胞Adv-Carom转染和NLS肽处理后,RT-PCR检测CXCLl0m RNA的表达。8、给予内皮细胞Hcy或Carom相关病毒转染后,体外进行血管再生实验,检测Hcy和Carom对内皮细胞血管再生的抑制作用。9、内皮细胞给予Hcy或Carom相关病毒转染后,分别给予两种细胞内吞抑制剂Mitmab和Chroquine,流式细胞仪检测Hcy和Carom对人血管生长因子受体2(VEGFR2)表达的影响。10、PIP array观察GST-Carom融合蛋白对磷酸肌醇的结合能力。用生物素标记膜蛋白,Hcy干预后观察细胞膜蛋白内吞的情况。11、内皮细胞过表达Carom,免疫共沉淀联合质谱筛选,Carom可能的相互作用蛋白。结果:1、RT-PCR发现Hcy可诱导HAEC Carom m RNA的表达,分别为对照组1.87倍(12h),2.72倍(24h)和2.45倍(48h)P<0.05。同时DL-Hcy可诱导内皮细胞Carom蛋白表达增加,并呈时间依赖性,48h Carom蛋白表达最高为对照组的2.2倍(P<0.05)。2、发现12-16周Tg-h CBS Cbs-/-小鼠血浆Hcy水平为50-100μm,Tg-h CBS Cbs+/-和Tg-h CBS Cbs+/+小鼠血浆Hcy水平小于10μm。血浆Hcy水平高的Tg-h CBS Cbs-/-小鼠主动脉及肺组织内皮细胞Carom的表达高于对照组小鼠,是对照组小鼠的1.4倍和1.6倍(P<0.05)。3、Hcy干预可增加内皮细胞SAH水平约为对照组的1.8倍(P<0.05),降低了内皮细胞SAM/SAH的比例由原来2.2降为0.5左右(P<0.05),导致内皮细胞的低甲基化水平。Actinomyosin D可阻断Hcy诱导内皮细胞Carom m RNA的表达。不同浓度甲基化抑制剂AZC干预内皮细胞后,Carom蛋白的表达增加分别为对照组的1.9和2.2倍(P<0.05)。4、Carom microarray筛选发现,与Adv-CT转染组相比,Adv-Carom转染组可使459个基因表达上调和460个基因表达下降(P<0.05,FC>1.2),Sh-RNA Carom可使653个基因表达下降,537个基金表达升高(P<0.05,FC>1.2)。其中有42个基因同时受Adv-Carom升高和sh-RNA Carom下降的调节。13个基因同时受Adv-Carom下降和sh-RANA Carom升高的调节。其中受Carom病毒转染变化最大的基因是CXCL10。5、DL-Hcy 50μm分别干预HAEC 12h、24h、48h小时,RT-PCR发现同型半胱氨酸增加内皮细胞Carom m RNA表达的同时,也增加CXCL10 m RNA的表达,并且在24h表达最高,升高为对照组22.1倍(P<0.05)。用内皮细胞过表达Carom后发现,Adv-Carom不仅能升高Carom m RNA的表达,同时CXCL10 m RNA也升高为对照组的27.5倍(P<0.05)。Carom Sh-RNA转染后,可抑制同型半胱氨酸诱导Carom的表达0.32倍(P<0.05),同时抑制Hcy诱导CXCL10 m RNA的表达1.1倍(P<0.05)。6、细胞划痕实验发现,Hcy刺激或Adv Carom病毒转染可抑制内皮细胞的迁移,Carom sh-RNA可改善Hcy对内皮细胞迁移的抑制作用(P<0.05),CXCLl0中和抗体(a-CXCL10)可减轻Carom对内皮细胞迁移的抑制作用(P<0.05)。7、WB结果发现Carom除了在细胞膜(ME)表达最多外,Carom还可以在细胞质(CE),可溶性细胞核(NE),染色质结合细胞核(CB)和细胞骨架(PE)中表达。同型半胱氨酸干预内皮细胞(HAEC)24h,Carom蛋白主要在CB和PE中表达增加,分别为对照组2.2倍和1.75倍(P<0.05)。Carom NLS肽可减少同型半胱氨酸诱导Carom在染色质结合细胞核(CB)中的表达,同时可抑制Carom诱导的CXCLl0 m RNA的表达,提示Carom调节CXCLl0的表达可能与细胞核内Carom的表达和Carom的入核运动相关。8、内皮细胞小管形成实验发现,内皮细胞降低Carom表达后,可改善同型半胱氨酸对内皮细胞血管生成的抑制作用,由原来的35%升高为80%(P<0.05),新生血管数量由原来的20上升至42(P<0.05);内皮细胞过表达Carom可明显抑制内皮细胞血管再生过程(P<0.05)。Carom对内皮细胞的增值作用无影响。9、流式细胞仪检测发现,与Adv-CT相比,过表达Carom组内皮细胞膜VEGFR2明显减少为28.6%(P<0.05),同型半胱氨酸也可抑制VEGFR2在内皮细胞的表达为41%(P<0.05),同时给予Sh-RNA Carom病毒转染后VEGFR2的表达升高为49%(P>0.05,无统计学意义)。内吞抑制剂Mitmab可改善同型半胱氨酸和Adv-Carom对内皮细胞膜VEGFR2表达的抑制,分别由原来39%升高至58%,39%升高至51%(P<0.05),Chroquine对VEGFR2表达无影响。10、PIP array表明GST-Carom融合蛋白易与各种磷酸肌醇结合,对Ptdlns(3)P及Ptdlns(3,5)P亲和力最大。细胞膜蛋白生物素标记细胞内吞实验表明,Hcy可诱导内皮细胞Carom及VEGFR2的内吞作用。11、免疫共沉淀蛋白印迹实验(Co-IP)发现在Hcy刺激下,Carom不能与VEGFR2,CASK和MAGI1连接发生相互作用。过表达Carom免疫共沉淀联合蛋白质谱分析发现,Carom可能在内皮细胞有13个相互作用蛋白,其中TRIM21可能通过与Carom连接,参与和介导Carom在内皮细胞的内吞。结论:1、Carom可在Hcy诱导的内皮细胞和高Hcy血症的小鼠肺内皮细胞和主动脉中高表达,其机制可能与内皮细胞低甲基化水平相关。2、过表达Carom可增加CXCLl0 m RNA的表达,Carom可能通过CXCLl0介导Hcy对内皮细胞迁移功能的抑制,其机制可能与Carom NLS介导的染色质结合细胞核(CB)Carom的表达增加及Carom的入核运动相关。3、Carom可介导Hcy对内皮细胞血管生成的抑制,抑制内皮细胞膜VEGFR2的表达,其机制可能与Carom介导的细胞内吞作用相关。