研究目的：恶性肿瘤严重危害人类生命和健康，近两年我国恶性肿瘤发病率上升迅猛，以超过心血管疾病，占死亡原因第一位，每年新增患者约220万人。多数肿瘤病人就诊时已处于晚期，并且缺乏有效的治疗方法。急需在多个水平深入研究导致肿瘤的发生和转移的分子异常，进而为肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗方法提供新的理论依据。肿瘤的本质是遗传信息异常的疾病，遗传学和表观遗传学的改变共同参与了肿瘤的发生、发展和转移的多个阶段。表观遗传学是指非基因序列改变所导致的基因表达水平的变化，包括染色质重塑，DNA甲基化，组蛋白乙酰化，microRNA，longnon-coding RNA等。其中，DNA的甲基化异常在肿瘤的演进过程中发挥重要作用，其所致的基因的不稳定性是肿瘤发生的重要诱因。肿瘤的重要特点是全基因组的低甲基化和位点特异CpG岛的高甲基化，包括抑癌基因启动子区的高甲基化导致的基因沉默和某些癌基因启动子区的低甲基化导致的肿瘤激活。抑癌基因的启动子异常高甲基化存在几乎所有的人类肿瘤中，参与多条信号通路并调控多种生物学过程。分析启动子区甲基化水平是寻找肿瘤中异常基因变化的有效方式。我们通过对肿瘤的表观遗传组学研究，首次发现SRY-box containing gene10(SOX10)基因的启动子区在肿瘤中存在异常的高甲基化，是潜在的抑癌基因。SOX10属于SOX家族，该家族成员的共同特点是含有和Sry (sex determinationregion of Y chromosome)基因的HMG（high mobility group）结构域相似的DNA结合域，引导SOX蛋白和特异DNA结合并导致DNA弯曲，因而SOX蛋白属于结构性转录因子（architectural transcription factor）的一种。根据HMG结构域的相似度不同，分为A-J不同亚族，SOX8，SOX9和SOX10共同属于SOXE亚族，HMG的相似程度达98%。SOX基因家族是进化过程中高度保守的一族基因，参与干性维持，细胞定向分化，组织形成等。SOX10在神经嵴和外周神经系统的形成，Schwann细胞和oligodendrocyte细胞的成熟和终末分化，黑色素细胞的形成中均发挥重要作用，而SOX10突变可导致Waardenburg-Shah和Waardenburg-Hirschsprung。SOX蛋白表达及功能的异常和多种肿瘤的发生密切相关。有些SOX蛋白在肿瘤中异常高表达,发挥癌基因的功能,如SOX2, SOX3, SOX4, SOX5等。部分SOX在肿瘤中低表达，发挥抑癌基因的功能，如SOX1, SOX17, SOX7, SOX11等。SOX10在肿瘤组织中的表达，生物学功能及分子机制尚未不明确。我们利用免疫组化技术检测SOX10在多种实体肿瘤及对应的癌旁组织中的表达，构建慢病毒表达载体，在多种肿瘤细胞系中研究其生物学功能，并深入研究其发挥功能的分子机制。研究方法及结果：1.免疫组化检测SOX10在正常组织及多种肿瘤组织中的表达：通过细胞荧光及Western Blottting验证抗体的特异性。利用Envision法检测SOX10在正常组织，食管癌，胃癌，结直肠癌及相应癌旁组织中的表达情况。SOX10在多种正常组织中高表达，包括正常脑，食管，胃，结直肠，胰腺，前列腺，睾丸等。SOX10蛋白定位于细胞核。在16例黑色素瘤中高表达。和癌旁组织相比，在不同肿瘤组织中表达下降，分别为食管癌51%(20of39),胃癌68%(23of34),结直肠癌51%(20of39)。2. SOX10对肿瘤转移潜能的调节作用选择SOX10表达缺失的食管癌KYSE150，结肠癌HCT116，胃癌AGS细胞，利用慢病毒载体将SOX10导入肿瘤细胞，和对照组相比，上调SOX10表达后，肿瘤的生长能力，细胞迁移和侵袭能力显著下降。过表达SOX10可以显著抑制细胞EMT及相关的干性。3. SOX10负向调节Wnt/β-catenin信号通路实时定量PCR，Western Blottting及荧光素酶报告基因实验证实上调SOX10抑制Wnt/β-catenin信号通路。免疫共沉淀及GST pull-down表明SOX10通过高度保守的“DVAELDQYL” motif和β-catenin结合，直接抑制其转录活性。该motif突变导致SOX10与β-catenin的相互作用减弱。SOX10和TCF4竞争结合β-catenin。染色质免疫共沉淀证实SOX10通过自身的HMG结构域，直接和下游靶基因的启动子区结合。SOX10HMG结构域的突变体SOX10-482ins6导致SOX10失去DNA结合能力，进而对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。4. SOX10发挥抑癌基因功能部分依赖和β-catenin的相互作用及自身的DNA结合能力构建SOX10“DVAELDQYL” motif的两种突变体SOX10-DB，SOX10-3G及HMG结构域突变体SOX10-482ins6。实时定量PCR，Western Blottting及荧光素酶报告基因实验证实这三种突变体均丧失对负向调节Wnt/β-catenin信号通路的负向调节作用。通过克隆形成及细胞迁移实验发现，SOX10-DB，SOX10-3G及SOX10-482ins6部分失去了抑制肿瘤细胞增殖和迁移的能力，证实SOX10发挥功能部分依赖和和β-catenin的相互作用及自身的DNA结合能力。结论：1. SOX10在多种正常组织中高表达，但在多种实体瘤组织中有不同程度的下降，表明SOX10表达失调参与多种肿瘤的发生和发展；2.体内体外试验证实上调SOX10抑制肿瘤增殖及迁移能力，是通过负向调节EMT及相关stemness，说明SOX10是重要的肿瘤抑制基因。3. SOX10通过和β-catenin直接结合负向调节Wnt/β-catenin信号通路，并且SOX10发挥抑癌基因功能部分依赖和β-catenin的相互作用及自身的DNA结合能力，阐明了肿瘤中Wnt/β-catenin信号通路失活的新机制。本课题通过临床病例分析及体内体外实验，首次阐明了SOX10在肿瘤中是重要的抑癌基因，提出肿瘤发生发展的新机制，为探究抑癌基因甲基化与恶性肿瘤发生及转移提供新的线索，为肺癌的治疗提供新的思路。