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青贮是一种以新鲜的青绿饲料为原料,利用植物表面自然附生的乳酸菌,在密闭条件下,通过厌氧发酵,将植物表面的可溶性碳水化合物转化为有机酸,导致饲料pH值降低,来抑制腐败微生物菌群的生长繁殖,从而达到保持作物的营养特性的目的的技术。其有着其独特的,其它种类饲料所无法比及的优点:青贮饲料能够较好的保存原料的蛋白、可溶性碳水化合物、小分子维生素和矿物质的含量,便于牲畜吸收利用,提高青贮饲料的消化率的同时也提高了生产率;其适口性好,利于牲畜采食;青贮过程中有益微生物的活动,如乳酸菌产生的乳酸可以杀死很多牲畜的病害微生物、寄生虫卵等。人为的添加一些工程乳酸菌作为青贮剂,能促进有益微生物的活动,可以进一步降解原料中的纤维素成分转化为小分子的单糖、寡糖或者低聚糖,便于牲畜吸收利用,提高青贮饲料的消化率。本实验以在模式大肠杆菌菌株Rosetta和乳酸菌菌株NZ9000中表达瑞氏木霉(Trichoderma reesei)CBHⅡ基因的方法,得到两株能表达外源纤维素酶的工程菌;然后,利用REAL-TIME RT-PCR对外源基因在工程乳酸菌中的转录水平表达进行准确的绝对定量分析,建立一种新的REAL-TIME RT-PCR分析方法,同时利用pNPC法测定了工程菌的酶活力,为构建青贮用工程乳酸菌提供了一种技术路线和对其进行相关指标评价的方法。通过实验得到如下结果:将纤维素酶基因CBHⅡ与表达载体pET30a重组,构建了重组质粒pETCBH。将重组质粒转化Rosetta宿主菌,获得了重组菌株Rosetta(pETCBH);利用IPTG诱导重组菌株Rosetta(pETCBH),并通过pNPC法测定了重组纤维素酶CBHⅡ的活性,其活性为2.677U/mL。将纤维素酶基因CBHⅡ与表达载体pNZ8148重组,构建了重组质粒pNZCBH。将重组质粒转化NZ9000宿主菌,获得了重组菌株NZ9000(pNZCBH)。建立了利用基于DNA扣除法的REAL-TIME RT PCR对基因进行定量分析的方法,该方法平行性好,可信度高,可以在转录水平分析目的基因表达情况;同时,此方法从理论上解决了传统定量法结果不准确的问题。最后,通过两种聚丙烯酰胺凝胶银染色方法的比较,证明了硝酸银染色法的效果大大优于传统的考马斯亮蓝染色法。本实验在以下方面有所创新:1.建立了一种较准确的在转录水平检测外源基因在原核载体中表达的绝对量的方法。2.为构建青贮用工程乳酸菌提供了一条可以借鉴的技术路线。