论文部分内容阅读
预处理是木质纤维素生物炼制过程的核心环节,该过程中产生的主要抑制物呋喃醛和酚醛对后续酶解糖化环节中纤维素酶的水解效率及发酵环节中发酵菌株的生长代谢均会产生严重的抑制作用。因此,有效脱除呋喃醛和酚醛类抑制物是木质纤维素生物炼制得以高效完成的关键。生物脱毒是通过特定微生物的代谢将毒性抑制物进行降解或转化的一种抑制物脱除方式。采用专司生物脱毒的微生物在发酵前对抑制物进行脱除的方式被认为是一种有效的抑制物脱除策略,但该方法彻底脱除醛类抑制物所需时间较长,从而导致部分可发酵糖特别是木糖等半纤维素来源单糖的损失。实现醛类抑制物彻底脱除的同时有效保留可发酵单糖的一种优化生物脱毒策略是,强化生物炼制发酵菌株的抑制物降解或转化能力并在发酵阶段完成残余醛类抑制物的彻底脱除,从而实现高效的木质纤维素生物炼制发酵。本论文首先将一种干法生物脱毒工艺拓展应用至木质纤维素柠檬酸的生产过程中,然后对两株高抑制物耐受型生物炼制发酵菌株Gluconobacter oxydans DSM 2003和Corynebacterium glutamicum S9114脱除呋喃醛和酚醛抑制物的分子生物学机制和对生物炼制效率的提升进行了解析,最后利用生物炼制发酵菌株C.glutamicum S91 14进行了生物燃料脂肪烃的合成尝试。第一部分对工业柠檬酸生产菌株Aspergillus niger SIIM M288利用生物脱毒的玉米秸秆原料生产高浓度柠檬酸进行了研究。树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1是本实验室前期研究工作中筛选到的一株专司抑制物脱除的生物脱毒菌株,在木质纤维素干法生物炼制工艺的脱毒环节中占据重要地位,该脱毒方法已成功应用至木质纤维素乙醇、油脂、乳酸、葡萄糖酸和木糖酸等产品的生物炼制加工生产过程中。A.niger SIIM M288对玉米秸秆水解液中存在的呋喃醛和酚醛等抑制物比较敏感,导致该菌株在含有抑制物的玉米秸秆水解液中不能正常生长和发酵。利用A.resinae ZN1将预处理后玉米秸秆原料中的呋喃醛和酚醛抑制物脱除后,A.niger SIIM M288可在脱毒玉米秸秆水解液中实现高指标柠檬酸发酵。对柠檬酸发酵过程中的多种发酵参数如培养基组分、发酵温度、初始pH及诱导剂等优化后,最终在25%(w/w)固含量脱毒玉米秸秆水解液中发酵得到的柠檬酸浓度达100.0 g/L,基于葡萄糖的得率为94.1%,不仅达到了工业上柠檬酸分离纯化的浓度标准,也为木质纤维素柠檬酸的工业化生产提供了十分重要的可行性参考依据。第二部分对氧化葡萄糖酸杆菌G.oxycdans DSM 2003转化呋喃醛和酚醛抑制物的分子生物学脱毒机制进行了研究。本章节利用DNA芯片技术考察了该菌株分别在糠醛、5-羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、香草醛及丁香醛胁迫下的转录组。结果显示,醛类抑制物不仅会诱导G.oxydans DSM 2003细胞内及细胞膜上多个与醛类抑制物转化相关的氧化还原酶编码基因的上调表达,还会引起细胞内戊糖磷酸途径和细胞膜上呼吸链相关基因的上调表达,进而促进呋喃醛和酚醛的降解转化。此外,醛类抑制物的转化还涉及大量转运蛋白编码基因的响应,这些转运体可能与进入G.oxydans DSM 2003胞内的醛类抑制物的转化过程相关。本章研究结果中与醛类抑制物转化相关的细胞膜结合型脱氢酶的挖掘,为高抗逆生物炼制发酵微生物的构建提供一种新的代谢工程改造思路。第三部分对谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum S9114转化呋喃醛和酚醛抑制物的分子生物学过程进行了研究。本章节通过定量PCR技术对该菌株基因组中可能与醛类抑制物转化相关的93个基因分别在糠醛、5-羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、香草醛及丁香醛胁迫下的转录水平进行了定量分析。C.glutamicum S9114可以迅速将呋喃醛和酚醛转化为相应的醇和酸,呋喃醇和酚醇会继续转化为相应的呋喃酸和酚酸。qRT-PCR结果显示有多个醇脱氢酶、醛脱氢酶及氧化还原酶参与了呋喃醛和酚醛的转化。从定量结果中筛选出一些重要基因在C.glutamicum S91 14中进行过表达验证,结果显示在呋喃醛和酚醛胁迫下均显著差异上调表达的醇脱氢酶编码基因CGS9114_RS01115和CGS9114_RS10340,醛脱氢酶编码基因CGS9114_RS04340对五种典型醛类抑制物的转化均有促进作用。本章节研究结果对提升生物炼制发酵菌株对多种醛类抑制物的综合耐受能力具有重要参考价值。第四部分对细菌微生物的脂肪烃合成路径进行了初步的构建和评价。木质纤维素生物炼制工艺已成功应用至诸如乙醇和油脂等生物燃料的合成中,而烃类化合物作为另一种更具附加值和生产潜力的生物燃料也受到越来越多的关注。本论文将来自细长聚球藻Synechococcus elongatus PCC7942的长链脂酰-ACP还原酶的编码基因及脂肪醛脱羰基酶的编码基因进行密码子优化后,在Escherichia coli BL21及C.glutamicum S9114中分别进行了脂肪烃合成路径的构建。重组E.coli合成以十五烷和十七烯为主的直链脂肪烃,多种促进脂肪烃合成的策略考察结果显示增加长链脂酰-ACP还原酶蛋白的可溶性表达水平及阻断胞内脂肪酸的氧化路径均可以促进脂肪烃的合成。重组C glutamicu.则可以合成一些碳链长度超过23的超长链烃,推测其超长链烃的合成路径与该菌株胞内的脂肪酸代谢及分枝菌酸合成代谢路径相关。综上所述,针对不同生物炼制发酵菌株应对呋喃醛和酚醛类抑制物的差异表现,本论文采取不同的生物脱毒研究策略,实现了木质纤维素的高效生物炼制及高抑制物耐受型发酵菌株的拓展应用。本论文将干法生物脱毒工艺成功应用至木质纤维素柠檬酸生产中,完成了木质纤维素柠檬酸的高指标发酵;阐明了两株高抑制物耐受型发酵菌株G.oxydans DSM 2003和C.glutamicum S9114转化呋喃醛和酚醛的分子生物学机制,筛选并鉴定得到了与醛类抑制物转化相关的关键基因;利用高抑制物耐受菌株C.glutarricum S9114合成了超长链烃,并对其超长链烃的合成路径进行了推测。本论文的研究结果为木质纤维素生物炼制工艺的产业化推广和应用奠定了理论基础。