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研究背景:肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是以运动性呼吸困难进行性加重,以喘息、气短、干咳、喘憋为临床表现,以限制性通气功能障碍、低氧血症、慢性进行性弥漫性肺间质纤维化为特点的肺间质性疾病。肺纤维化既是多种肺疾病、多种系统性疾病的共同结局,又有无原发疾病的特发性肺间质纤维化。近年来,随着细胞和分子生物学等生命科学理论研究,多种研究手段的应用,从器官、组织、细胞、分子的不同层次,对肺纤维化的发生、诊断、防治的研究不断深入,取得极大的进展。研究表明,肺纤维化是由早期组织损伤、炎症变化发展而来,而肺部受感染或损伤后,肺泡上皮细胞和是最早受到损伤的靶细胞。由于肺泡表面约93-97%的肺泡Ⅰ型上皮细胞为终末细胞,不能进行分裂增殖,故具有增殖分化能力的肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar typeⅡcell,ATⅡ)是参与组织损伤修复的主要细胞,所以,最初肺损伤后发生于组织修复时的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化(epithelial to mesenchymaltransition,EMT)在肺纤维化发生发展过程中发挥着极其重要的作用。近年来随着对肺纤维化的发病机理的深入研究,无论中、西医均在治疗上取得相当进展。导师在长期的临床实践中,依照经验创立苈桃抗纤方,对肺间质纤维化患者进行雾化治疗,取得了一定的疗效。为了提高它的可信度和可重复性,为临床实践提供更好生命科学理论基础,在本实验中,我们主要研究苈桃抗纤方对肺泡Ⅱ型上皮细胞向问质细胞转化、EMT转化率以及对肺泡Ⅱ型上皮细胞转化过程中相关细胞转导通路的影响,在细胞及分子水平上探讨苈桃抗纤方抗肺纤维化的生物学基础。目的:由于肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化(EMT)是发生肺纤维化的重要因素,故在本次实验中,我们应用转化生长因子(transforminggrowth factor TGF-β1)诱导人肺上皮细胞系(A549)EMT发生,观察TGF-β1对A549增殖及形态变化的影响,研究苈桃抗纤方雾滴干预后对肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化的影响,从基于雾化中药制剂影响EMT发生的角度,初步探讨苈桃抗纤方防治肺纤维化的生物学基础。方法:使用不同浓度苈桃抗纤方体外干预A549细胞。免疫组化法检测细胞内TGF-β1的相对含量;通过TGF-β1体外诱导细胞EMT的发生,ELISA法检测细胞角蛋白(cytokeratin)及波形蛋白(Vimentin)表达,计算细胞EMT转化率;Real-time PCR法检测苈桃抗纤方对细胞内Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响;Western Blot检测细胞磷酸化(phosphorylation)Erk1/2的表达。结果:不同浓度苈桃抗纤方体外作用A549细胞48h后,胞内TGF-β1的定量表达,相较正常对照组明显减少(40.35±1.65,37.84±0.95,37.45±0.78 VS 45.13±2.01),(P<0.01)具有显著差异性。TGF-β1体外诱导A549细胞EMT发生后,ELISA检测细胞cytokeratin和vimentin表达显示,相较正常对照组,vimentin阳性表达明显增强,而cytokeratin阳性表达相对减弱;RT-PCR检测表明,A549细胞内Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达显著增强。经不同浓度苈桃抗纤方体外作用诱导EMT成功的A549细胞48h后,与模型组相比,vimentin阳性表达出现不同程度的减弱,而cytokeratin阳性表达则出现不同程度增强;Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达均出现不同程度下调;phosphorylation Erk1/2的表达减弱。结论:苈桃抗纤方可以降低TGF-β1诱导的A549细胞EMT转化率,阻断肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化,减少肺成纤维细胞的产生,从而抑制肺纤维化的发生,达到抗肺纤维化的作用。其可能机制是通过降低细胞内转化生长因子(transforming growth factor TGF-β1)的释放,干预Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达,影响细胞磷酸化Erk1/2的表达。