目前,对于乳腺癌的临床治疗方面,多采用手术、化疗、放疗、激素及靶向治疗等多种方式联合治疗的模式。化疗作为治疗乳腺癌的手段之一始终无法被规避。由于化疗为通过静脉全身给药,除了体内的一些解剖屏障(如血脑屏障等)外,肿瘤组织及大部分组织、器官都会受到常规化疗药物的影响,进而出现化疗药物对机体的正常细胞及肿瘤细胞的无选择性杀伤。多个周期化疗后患者可能出现药物的毒副作用的累积导致身体耐受能力减弱,肿瘤细胞对化疗药物敏感性下降。故医学工作者在乳腺癌治疗方面不断的探索,寻求更有效的治疗模式。而我们研究的透明质酸修饰的介孔硅包裹金纳米棒(Au NR@Si O2)纳米粒子可望解决这一问题,成为我们理想的药物载体:第一,Au NR@Si O2纳米粒子直径70 nm左右,能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞,而且结构相对稳定,可被人体代谢清除,细胞毒性小;第二,Au NR@Si O2纳米粒子具有介孔硅的特性,比表面积大,装载药物之后还有不同程度的缓释功能;第三,我们可以在Au NR@Si O2纳米粒子的表面修饰以透明质酸来封堵药物,避免在正常生理条件下出现泄露,而透明质酸(HA)可与乳腺癌细胞的表面过度表达的CD44受体特异性结合,通过细胞内吞作用进入细胞,实现智能控释作用;第四,该体系内部的金纳米棒可通过近红外光(NIR)照射产生光热作用,进一步凋亡肿瘤细胞。基于以上原因,我们设计了透明质酸修饰的介孔硅包裹金纳米棒的纳米载药体系(Au NR@Si O2-HA)。在介孔硅内部包裹金纳米棒,装载化疗药物阿霉素后表面修饰以氨基,进而通过酰胺键与透明质酸结合起到了封堵药物的目的。当到达靶细胞时透明质酸与其表面过量表达的CD44受体特异性结合,通过内吞作用将大量的纳米载体粒子集中在细胞内部,透明质酸被细胞内部的透明质酸酶降解,化疗药物阿霉素被释放,实现靶向给药的目的。而透明质酸修饰的介孔硅包裹的金纳米棒还具有光热效应,在近红外光的照射下,吸收光转换为热,通过升高局部温度凋亡肿瘤细胞,实现与药物化疗协同作用。【方法和结果】本实验制备透明质酸修饰的介孔硅包裹金纳米棒的纳米药物载体,检测其性能,通过实验证明这种药物载体能够在化疗及热疗双重作用下增强阿霉素(Dox)介导乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)凋亡的作用。一、Au NR@Si O2-HA纳米粒子的制备及其性能检测(1)首先,通过Na BH4还原HAu Cl4后进一步制备CTAB包覆的纳米金种子。纳米金种子在CTAB的保护下生长为金纳米棒,金纳米棒表面的CTAB作为模板通过溶胶—凝胶法包裹介孔硅,表面修饰为氨基(NH2)化。透射电子显微镜证实其制备成功,并通过紫外线可吸收光谱证明其光热效果。(2)介孔硅表面氨基与透明质酸的羧基反应形成酰胺键,将透明质酸嫁接到介孔硅表面,通过红外光谱、Zeta电势、水合粒径分布图证明表面修饰过程。(3)考察透明质酸修饰的介孔硅包裹金纳米棒纳米载体的光热效果:在808nm近红外光照射下(1.8 W/cm2,8 min)Au NR@Si O2-HA溶液(0.1 mg/m L)温度从19°C升高至30.3°C,其光热效果随浓度梯度的增加而升高;红外摄像机成像图进一步证明Au NR@Si O2-HA溶液的光热效果。二、Au NR@Si O2-HA纳米粒子装载Dox后的释放试验(1)通过Dox-Au NR@Si O2-HA紫外线可见吸收光谱中Dox吸收峰的出现证实Dox装载成功。考察Dox-Au NR@Si O2-HA在不同条件下的药物释放效果,结果表明在PBSp H 7.4、PBSp H 4.5和Hyal-1的3种条件下药物释放率分别为4.6%、8.6%及69.1%,证实该体系中Dox是透明质酸酶触发的可控释放。(2)把Au NR@Si O2-HA通过FITC进行荧光标记后,将其和MDA-MB-231细胞(表面富含大量CD44)共孵育,共聚焦荧光成像及流式细胞分析证实:MDA-MB-231细胞对Au NR@Si O2-HA具有良好的摄取能力。(3)将Au NR@FITC-Si O2及Au NR@FITC-Si O2-HA分别与MDA-MB-231细胞及对照组NIH-3T3细胞(成纤维细胞,细胞表面缺少CD44受体)共同孵育。通过共聚焦显微镜及流式细胞仪分析得出:两组细胞对Au NR@FITC-Si O2均较低,无明显差异;而MDA-MB-231细胞对Au NR@FITC-Si O2-HA摄取能力要明显高于NIH-3T3细胞,进一步证实该纳米载体对靶细胞的靶向能力。三、Dox-Au NR@Si O2-HA纳米粒子的细胞毒性试验(1)通过MTT实验得出:Au NR@Si O2-HA对MDA-MB-231细胞及NIH-3T3细胞均无明显的毒性;Dox-Au NR@Si O2-HA对MDA-MB-231细胞的毒性高于单独的Dox;而Dox-Au NR@Si O2-HA对NIH-3T3细胞的毒性低于单独的Dox。说明载阿霉素后的该载体对靶细胞的毒性明显高于正常细胞。(2)MTT实验评价化疗、热疗协同作用对MDA-MB-231细胞毒性效果:Dox-Au NR@Si O2-HA+NIR组的细胞毒性要高于Dox-Au NR@Si O2-HA组、Au NR@Si O2-HA+NIR组及Dox组,Au NR@Si O2-HA+NIR组与Dox组的细胞毒性结果接近。证实通过该纳米载药体系对MDA-MB-231细胞化疗、热疗协同作用产生的细胞毒性要大于单纯的化疗或光热治疗。(3)Annexin V-FITC/PI双染法检测证实该纳米载体通过化疗、热疗协同作用于MDA-MB-231细胞后凋亡率:Dox-Au NR@Si O2-HA+NIR组细胞凋亡率最高,Dox-Au NR@Si O2-HA组的细胞凋亡率高于Dox组。证实该药物载体能够通过化疗及热疗双重作用提高靶细胞的凋亡率。四、评价Dox-Au NR@Si O2-HA纳米粒子对接种MDA-MB-231细胞的荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用(1)通过对肿瘤生长曲线和终末体积的测量与计算,得出该载药体系对肿瘤的抑制作用结果:Dox-Au NR@Si O2-HA+NIR组抑瘤效果最好,而Dox-Au NR@Si O2-HA组的抑瘤效果优于Dox组。(2)Tunel检测法的结果证明Dox-Au NR@Si O2-HA+NIR较Dox-Au NR@Si O2-HA组和单纯Dox组处理的肿瘤组织有着更强的凋亡趋势表现。(3)通过Western blot实验来进一步检测肿瘤组织内的细胞凋亡因子,结果证实Dox-Au NR@Si O2-HA+NIR组、Dox-Au NR@Si O2-HA组和单纯DOX组分别作用于MDA-MB-231细胞后,前者的p53和Bax的表达高于后面两组,而bcl-2的表达低于后面两组,证实出现了有效的细胞凋亡。【结论】本研究首次将将介孔硅包裹的金纳米棒纳米粒子载药体系与透明质酸相结合,通过在该体系内的介孔中装载阿霉素,有针对性的应用于表面富含CD44的乳腺癌MDA-MB-231细胞。结果证实该系统在特异性杀伤乳腺癌MDA-MB-231细胞、降低化疗毒副作用方面有较大优势。而且这种药物载体能够在化疗及热疗双重作用下增强Dox介导MDA-MB-231细胞凋亡的作用。