研究背景皮肤角质类脂体又名神经酰胺脂质体(Cerasomes,CS),是皮肤局部给药系统中借助脂质体技术发展而来的一种新型递药系统,主要由极性接近皮肤角质层的神经酰胺(ceramides)、胆固醇、棕榈酸和胆固醇硫酸酯等组成。皮肤角质类脂体的磷脂双分子层由类角质层脂质组成,其中神经酰胺作为皮肤角质层的重要成分之一,具有保湿、维持皮肤屏障、抗过敏、抗衰老、诱导细胞凋亡等生理功能,具有潜在的医疗应用价值。神经酰胺与脂质体的结合,其优势主要表现在:①其类角质组成成分和成分极性与角质层相近,所以与普通脂质体相比更易于角质层相互融合,从而显著提高药物的皮肤渗透;②增强药物的稳定性:皮肤角质类脂体作为一种载体包封药物或活性成分时能提高药物的稳定性和生物相容性,使其能够更稳定地释放到相应的组织中;③毛囊靶向性:脂质体本身具有毛囊靶向作用,从理论上来讲能够将药物尽可能多地导向至毛囊疾病的病变部位。隐丹参酮(cryptotarlshinone,CTS)是从活血化瘀要药丹参的脂溶性成分中分离出的一种有效单体。总丹参酮分离的化学成分经体外抑菌试验证明,隐丹参酮的抑菌活性最强,且含量较高。隐丹参酮在改善皮肤微循环、消退炎症、修复皮损等方面也体现出较强的活性,常用于治疗痤疮。临床上使用以隐丹参酮为有效成分的丹参制剂治疗炎症性和脓疱性痤疮效果显著。痤疮作为一种常见于青春期和成人期的毛囊皮脂腺慢性炎症皮肤病,其发病率高且病情反复,易对患者的身心健康造成极大的伤害。目前,市面上含有隐丹参酮的治疗痤疮的外用成药主要有丹参酮软膏、克痤隐酮软膏、克痤隐酮凝胶等。然而在对隐丹参酮进行研究的过程中,其逐渐显现的一些缺点限制了它的实际应用:①脂溶性大,水中溶解性差;②在避光和非溶液状态下最稳定;③对肝药酶有诱导作用。因此,本实验选择对痤疮具有确切疗效的中药单体隐丹参酮为模型药物,将其包裹于一种皮肤局部给药新剂型——皮肤角质类脂体中,以增强药物的稳定性,丰富现有的痤疮外用药新剂型。研究目的本课题的研究目的是设计一种新型的皮肤靶向给药制剂——隐丹参酮皮肤角质类脂体制剂。以中药单体隐丹参酮的理化性质研究为基础,对制备原料和工艺进行筛选和优化,得到一种包封率高、粒径分布均匀的皮肤角质类脂体。通过体外药物渗透行为研究及药动学研究来证实皮肤角质类脂体制剂相比于普通制剂在提高药物与皮肤角质层融合的能力及药物在皮肤的局部生物利用度方面体现的优势;通过药效学研究来探索隐丹参酮皮肤角质类脂体制剂在治疗痤疮时产生的作用机制,从而为其在药物传递中显现的优势提供理论依据。对PK-PD模型进行拟合研究,以阐明药物浓度与药效之间的关联度。研究方法1.隐丹参酮皮肤角质类脂体的处方前研究及不同含量测定方法的建立采用全波长扫描确定隐丹参酮的最大吸收波长,选择适用的色谱条件建立隐丹参酮、隐丹参酮皮肤角质类脂体、隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的含量测定方法;考察不同溶剂中隐丹参酮的溶解度;采用正辛醇-水系统,考察隐丹参酮的油水分配系数。2.隐丹参酮皮肤角质类脂体的制备工艺研究及凝胶的制备以膜材比、磷脂/药物比例和温度为考察因素,以包封率和分散系数为效应值,采用星点设计-效应面法进行三因素五水平的实验设计,建立每个因素对效应值影响的三维面图,建立模型拟合方程,从而优选隐丹参酮皮肤角质类脂体的制备工艺。用透射电镜对形成的隐丹参酮皮肤角质类脂体进行形态观察,用电位粒度分析仪来检测粒径及粒径分布的均匀性。制备隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶和隐丹参酮普通凝胶。3.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的体外释药行为研究采用Franz扩散池来考察大鼠皮肤分别给予1g隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶或1g隐丹参酮普通凝胶后药物在皮肤渗透行为上的差异。用HPLC法测定连续14个时间点所采集到的接收液—生理盐水(含20%PEG-400)中隐丹参酮的含量。将药物的累积透过量对时间作图,得到隐丹参酮从两种凝胶中释放的透过曲线及渗透速率。采用不同的模型拟合方程,对隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶和隐丹参酮普通凝胶的药物释放行为进行分析。测定体外透皮实验4h、8h、12h和24h后皮肤中隐丹参酮的含量,比较两种凝胶中药物在皮肤中滞留量的差异。4.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的药动学研究对大鼠皮肤进行痤疮造模。预先麻醉大鼠,分别在大鼠背部真皮层和颈静脉植入微透析探针,以2μL·min-1的速度灌流生理盐水(含20%PEG-400),平衡1h后在大鼠背部涂抹1g隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶或1g隐丹参酮普通凝胶,此后每隔30min采集一次透析液,共采集12h并测定药物的浓度。对两种凝胶的局部药动学和整体药动学数据进行统计及参数分析,阐述皮肤角质类脂体制剂对隐丹参酮局部生物利用度的影响。5.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的药效学研究采用100%油酸连续涂抹造成大鼠背部痤疮模型,观察隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶对痤疮皮肤外观改变;采用HE染色病理切片观察大鼠背部皮肤组织在给药前后正常皮肤和病理皮肤的差异。用免疫组化法和Western Blot方法对大鼠皮肤中与痤疮有密切关系的指标IL-1α,IL-8,SP,AR进行检测,探索制剂药效与指标改变间的联系。6.PK-PD模型拟合研究运用微透析采样技术同时采集药代动力学和药效动力学样本,结合液相芯片快速检测方法,对给予隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶后的局部药代动力学和局部药效动力学进行模型拟合研究,以阐明药物浓度与药效之间的关联度。研究结果1.隐丹参酮皮肤角质类脂体的处方前研究及不同含量测定方法的建立隐丹参酮的最大吸收波长为263nm。用HPLC法建立隐丹参酮的色谱条件为:Agilent HC-C18 柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(80:20),检测波长为263nm,流速为1mL·min-1,柱温为25℃。建立以甲醇为溶剂的药物标准曲线:y=286.51x+6.2507(r=0.9999),隐丹参酮在0.114～11.4μg·mL-1 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。建立以生理盐水为溶剂的标准曲线:y=0.559x+11.374(r=0.9995),隐丹参酮在12.75～5100ng·mL-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。隐丹参酮在蒸馏水、生理盐水及不同pH的PBS溶液中的溶解度很小,在生理盐水(含20%PEG-400)中的溶解度为18.23μg·mL-1。隐丹参酮的油水分配系数为1.78。2.隐丹参酮皮肤角质类脂体的制备工艺研究及凝胶的制备以最高包封率和最小分散系数为筛选指标,得出最优处方:膜材比为5.62:1、脂药比为80.01:1、温度为51.24℃。据最优工艺预测的药物包封率为62.29%、分散系数为0.26。形态学观察结果显示隐丹参酮皮肤角质类脂体是类球形的封闭囊泡,外有单层或多层磷脂膜,膜内有药物包裹。3批样品的包封率为59.90%±1.75%,平均粒径为119.53±13.85nm,粒径的分散系数为0.25±0.025。制备的隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶呈浅橙色,均匀、细腻、无气泡,具适当的黏稠性,易涂布。测得的隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶中药物含量为102.70μg/g,隐丹参酮普通凝胶中药物含量为102.54μg/g。实验期间凝胶无酸败、分层、变色等变质现象。3.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的体外释药行为研究隐丹参酮从两种凝胶中的释放符合零级动力学方程,其中隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的渗透速率为4.0968±0.22μg·cm-2·h-1;隐丹参酮普通凝胶的渗透速率为3.0550±0.21μg·cm-2·h-1,低于前者。皮肤滞留量结果显示,隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的皮肤滞留量在各个时间点均明显高于隐丹参酮普通凝胶。测定结果分别为:4h(0.27±0.001mg·cm-2、0.50±0.03mg·cm-2);8h(0.52±0.005mg·cm-2、0.53±0.019mg·cm-2);12h(0.60±0.038 mg·cm-2、0.88±0.106mg·cm-2);24h(0.85±0.100mg·cm-2、0.96±0.098mg·cm-2)。4.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的药动学研究真皮层组织液中,隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶组的药时曲线下面积为27.99±0.89μg·mL-1·h-1,达峰时间为3.67h,药物消除时间为9.90h;而隐丹参酮普通凝胶组分别为19.18±0.62μg·mL-1·h-1,9.17h,5.44h。血液微透析结果显示,隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶组的药时曲线下面积为3.31±0.27μg·mL-1·h-1,达峰浓度为0.45±0.09μg·mL-1;而隐丹参酮普通凝胶组分别为9.39±0.38μg·mL-1·h-1,1.36±0.19μg·mL-1。隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶在皮肤局部的累积药物浓度较高、达峰较快、消除较慢、药物较少进入体循环,且两组药动学参数具有显著性差异(P<0.05)。5.隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的药效学研究采用100%油酸连续涂抹成功制备大鼠背部痤疮模型。HE染色结果显示,大鼠背部给药2周后,隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶组皮肤真皮浅层炎症细胞浸润减少;皮脂腺斑中皮脂腺数量减少、体积变小且排列疏松;免疫组化法及Western Blot结果显示给予隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶后炎症因子IL-1α、IL-8的表达下调,且雄激素受体的表达明显下调。6.PK-PD模型拟合研究隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶皮肤局部给药后,药物浓度在真皮层逐渐升高的过程中,药效动力学指标浓度逐渐下降,即抑制效应逐渐增强,药物浓度保持相对平稳时期,药物在体内有一定的蓄积,对药效动力学指标仍然呈现抑制状态,后有回升趋势。结论1.隐丹参酮处方前研究表明,建立的含量测定方法线性关系良好,精密度高,准确度高,稳定性强。隐丹参酮在生理盐水(含20%PEG-400)中的溶解度能够满足其进行体外透皮实验的要求,油水分配系数结果表明其具有良好的皮肤扩散性能。2.隐丹参酮皮肤角质类脂体制备工艺研究表明,星点设计-效应面法能够很好的筛选其制备工艺,得到的三维效应面图能够直观的反映膜材比、脂药比及温度三个因素对包封率和粒径分布的影响。建立模型拟合方程的归一值接近1,表明测得的效应值接近预测值。3.体外释药行为结果表明,将隐丹参酮制备成皮肤角质类脂体制剂,能够提高隐丹参酮透过角质层的渗透速率,增加药物的皮肤滞留量。4.药动学研究表明,隐丹参酮皮肤角质类脂体制剂能够提高隐丹参酮的皮肤局部生物利用度,且12h的持续释放时间使药物能够在皮肤长时间保持有效浓度。5.药效学研究表明,隐丹参酮皮肤角质类脂体制剂能够减轻炎症,对毛囊口角化程度及皮脂腺分泌异常具有改善作用。结果提示该痤疮模型的形成初期可能与炎症因子IL-8的异常表达有关,IL-1α可能参与该痤疮模型中角化异常的形成,隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶可能通过对雄激素受体的竞争性抑制来抑制雄性激素对皮脂腺斑的刺激,且可能对IL-1α、IL-8的表达产生抑制作用。6.PK-PD模型研究说明隐丹参酮皮肤角质类脂体凝胶的药物效应明显滞后于药物浓度的增加。