类风湿类节炎(RA)是一种慢性、系统性自身免疫病,成纤维样滑膜细胞(FLS)类肿瘤样增生是RA的特征性病理表现,树突状细胞(DCs)作为功能强大的抗原提呈细胞,在炎症免疫反应中起重要作用。DCs上有前列腺素受体(EP)四种亚型的表达,但RA DCs上EP不同亚型的表达情况及其对DC功能的调控尚不清楚；前列腺素E2 (PGE2)是引起FLS异常增殖的重要分子之一,PGE2通过G蛋白偶联的EP信号通路调节细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平是滑膜细胞异常增殖的重要机制,G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是G蛋白偶联受体(GPCRs)的负性调节剂,可特异性地活化GPCRs,使其磷酸化,从而介导受体脱敏,但FLS对EP信号尤其是对EP4信号的的调节未见报道。课题组将白芍总苷(TGP)的活性单体芍药苷(Pae)进行酯化修饰,得到的新型活性单体-苯磺酰芍药苷(芍药苷-6-氧-苯磺酸酯,代号CP-25)具有一定的抗炎作用。然而CP-25对免疫性关节炎是否具有治疗作用,其作用机制如何,还不清楚。本课题在以往研究工作基础上,建立大鼠佐剂性关节炎(AA)模型,以DCs和FLS为研究细胞,运用流式细胞术、QRT-PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、激光共聚焦、小干扰RNA等技术,观察PGE2对DCs和FLS功能的影响及CP-25的作用,为揭示PGE2及其信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制及CP-25的作用靶点提供实验依据。目的：观察PGE2及其信号对大鼠DCs和FLS功能的影响及CP-25对大鼠AA的治疗作用及机制,为揭示PGE2及其信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制以及CP-25的作用靶点提供实验依据。方法：采用完全弗氏佐剂制备大鼠AA模型,取大鼠骨髓源细胞,经rIL-4、rGM-CSF刺激诱导生成骨髓源DCs; QRT-PCR法检测EP mRNA各亚型的表达。流式细胞术检测DCs抗原摄取功能和表型CD80, CD86, CD40和MHCⅡ的表达及FLS表面EP4和GRK2的表达；DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)和FLS的增殖采用CCK-8法检测；ELISA法检测PGE2, IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-23和cAMP的水平；CP-25灌胃给药,进行多发性关节炎指数评分；HE染色观察关节病理；激光共聚焦显微观察法检测EP4和GRK2在FLS上的分布；免疫共沉淀法检测FLS上EP4和GRK2的相互作用；siRNA瞬时沉默FLS中GRK2基因表达；Western blot法检测EP4和GRK2在FLS胞膜表达。结果：1.PGE2信号对AA大鼠DCs功能的影响大鼠骨髓源DCs表达EP的四种亚型,与正常大鼠相比较,AA模型大鼠骨髓源DCs上EP4 mRNA表达明显上调。在AA大鼠病程研究中发现,骨髓源DCs分泌的PGE2, TNF-α, IL-23等炎症介质和细胞因子在AA大鼠继发性炎症高峰期和缓解期均较致炎前显著升高；外周血CD103+细胞中DC共刺激分子CD40和CD86在d7就较致炎前升高,CD80和MHCⅡ在继发性炎症初始阶段(d17)开始增加,而在BMDCs中,MHCⅡ、 CD86和CD40均在原发性炎症阶段(d7)就开始升高,随着炎症的加重,这些DCs表型表达均显著升高。提示,在AA炎性进程中,PGE2、 EP及DC表型出现异常变化。体外进一步模拟AA炎性环境,在TNF-α刺激下,观察PGE2对DCs功能的影响,结果发现PGE2刺激组DCs的抗原摄取能力明显降低,PGE2可浓度依赖性的增加DCs的IL-23分泌,同时,显著增加DCs的IL-12分泌,增加DCs对T细胞的刺激能力。EP4激动剂CAY10598可模拟PGE2对DCs的效应,增强DCs对T淋巴细胞的刺激能力,上调DCs表面CD80的表达,而EP2激动剂Butaprost和CAY10598可促进DCs的IL-23分泌,上调MHCⅡ和CD86的表达,但EP1和EP3激动剂Sulprostone对这些功能没有影响。cAMP类似物dbcAMP增加DCs的IL-23、L-12产生和MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表达,说明PGE2/EP4-cAMP信号介导的DCs功能异常参与了AA炎症反应。研究还发现PI3K抑制剂上调了PGE2诱导DCs的IL-23和IL-12产生,但抑制了DCs表面MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表达,PI3K参与PGE2调控DCs功能的机制有待进一步研究。2.PGE2信号对AA大鼠FLS功能的影响TNF-α在AA大鼠早期炎症反应即开始升高,在炎症高峰期(d23)和炎症缓解期(d30), PGE2和TNF-α均较致炎前高。PGE2可浓度依赖性的刺激FLS增殖,10μM时刺激作用最强。Western blot和流式检测均提示AA大鼠FLS胞膜蛋白EP4显著降低；GRK2在胞膜中表达显著升高。那么GRK2的高表达是否与胞膜EP4降低有关呢?我们用PGE2刺激AA大鼠FLS,结果发现GRK2在PGE2刺激10 min就开始升高,随着刺激时间的延长,GRK2表达呈上升趋势。而EP4在PGE2刺激20 min开始表达升高,2 h左右达高峰,12 h时表达较未刺激时降低。为进一步分析FLS胞膜EP4减少的原因,先用PGE2 (10μM)预刺激30 min,可升高FLS细胞膜上EP4表达,然后在PGE2基础上再用EP4激动剂刺激FLS,结果发现EP4激动剂可逐渐降低胞膜EP4表达,刺激30min时低于基础水平,而胞膜GRK2表达逐渐升高。与对照组相比较,TNF-α组在同等条件下EP4表达降低更明显,GRK2表达却逐渐升高。其下游信号分子cAMP经PGE2预刺激可明显增加,但随着EP4激动剂刺激时间的延长,cAMP水平逐渐降低,30 min时低于未刺激组,1h时cAMP浓度降低有统计学差异。TNF-α组在同等条件下,cAMP 水平降低更明显,提示在TNF-α炎性细胞因子作用下,EP4激动剂可进一步促进EP4的脱敏,从而导致下游信号cAMP水平的降低。激光共聚焦显微镜观察FLS,发现EP4和GRK2主要分布在胞浆和胞膜,经共定位显示Overlap Coeffcient为0.6595,提示EP4和GRK2存在一定的相互作用；免疫共沉淀法进一步显示,在正常情况下,GRK2-EP4有比较弱的作用,EP4激动剂刺激1h显著增加GRK2的表达,提示GRK2-EP4的相互作用增强。为进一步探讨GRK2在EP4异常脱敏中的作用及PGE2对FLS功能的影响,用siRNA沉默GR.K2基因表达后,发现可取消PGE2引起的FLS异常增殖,EP4在激动剂刺激下逐渐向细胞膜聚集,随着刺激时间的延长EP4胞膜表达逐渐升高。经PGE2预刺激的FLS再用EP4激动剂刺激30 min和24 h的胞内产生cAMP水平与未刺激的GR.K2基因沉默FLS相比无显著性差异。这些结果表明GRK2在调节滑膜细胞异常增殖中发挥了重要的作用,其可能通过促进EP4脱敏,导致下游信号分子cAMP水平降低从而引起FLS的异常增殖。3.CP-25对大鼠AA的治疗作用及部分机制CP-25可明显降低AA大鼠的多发性关节炎指数评分,可不同程度的改善关节病理变化,主要表现为炎性细胞浸润减少,滑膜细胞增生减轻,炎性渗出和血管翳形成减少,滑膜组织破坏软骨、骨罕见。表明CP-25对大鼠AA具有治疗作用。CP-25可不同程度降低PGE2和TNF-α水平,降低AA大鼠FLS的异常增殖反应。CP-25可显著下调DCs表面MHCⅡ, CD40和CD80的表达,但对CD86的表达无明显影响。CP-25体外给药可提高DCs的吞噬能力,下调CD80, CD86和MHCⅡ的表达,抑制对T细胞的增殖作用,不同程度的抑制IL-23分泌。CP-25体外给药可不同程度抑制FLS的增殖,且呈明显的浓度效应关系。CP-25可显著升高胞膜EP4的表达,同时不同程度抑制胞膜GRK2表达。进一步在体外把DCs和FLS按一定比例进行接触式混合培养,以部分模拟体内的环境,结果发现,PGE2处理的DCs可显著促进FLS的增殖,增加FLS分泌IL-1β, CP-25体外给药可不同程度抑制FLS的增殖及细胞因子的分泌。此外,把PGE2处理的FLS与DCs按1比10比例进行混合培养,发现PGE2处理的FLS,可显著促进DCs分泌TNF-α,而CP-25处理的FLS可抑制DCs分泌TNF-α,体外实验进一步证实了CP-25可以改善FLS和DCs的功能,提示CP-25可能通过调节AA大鼠异常的免疫功能和抑制FLS的异常增殖而发挥治疗作用。结论：1.PGE2及其EP4-cAMP信号亢进导致AA大鼠DCs功能异常活化,并与病程相关；2.AA大鼠PGE2异常升高,导致EP4膜表达下降(过度脱敏),与FLS异常增殖以及与FLS和DCs的相互活化有关；3.AA大鼠FLS的GRK2异常升高,并EP4共表达,可能是导致EP4脱敏的主要原因；4.CP-25对大鼠AA的治疗作用与其改善DCs功能、抑制FLS异常增殖和分泌炎症因子有关,该作用可能是通过降低FLS GRK2膜表达和上调EP4膜表达,抑制EP4的过度脱敏实现的。