目的：肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是免疫抑制性肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。靶向TAMs的理想方法不是清除它们，而是将TAMs由促肿瘤的M2型巨噬细胞重塑为抗肿瘤的M1型巨噬细胞。我们首次发现Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependentproteinkinaseII，CAMKII)的特异性抑制剂KN93既具有直接的抑瘤活性，又具有重塑TAMs向抗肿瘤的M1型巨噬细胞极化的能力。然而，在体内应用这些小分子抑制剂往往会遇到细胞摄取效率低、循环时间短、诱导免疫原性细胞死亡水平低，从而难以有效激活体内抗肿瘤免疫应答的问题。为此，我们筛选出一种具有良好的成胶性能和抗肿瘤活性的蜂毒肽水凝胶MR52负载KN93(MR52-KN93，MRK)，探究MRK对黑色素瘤和恶性腹水的抗肿瘤效应及对TAMs重塑的影响，并初步探索MRK发挥双重效应的相关机制。
　　方法：首先，通过CCK8实验验证KN93对B16F10细胞增殖的影响；通过流式细胞术检测KN93对骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages，BMDMs)极化的影响；RNA测序分析KN93处理后的BMDMs转录组mRNA水平的改变。同时，从一系列蜂毒肽-(RADA)n水凝胶支架中筛选出具有最佳特性的MR52。接下来，CCK8、克隆形成实验、细胞周期与凋亡实验验证MRK的抗肿瘤活性；流式细胞术检测MRK重塑BMDMs向M1型巨噬细胞极化的作用。此外，通过检测MRK作用后B16F10细胞的活性氧水平、三磷酸腺苷水平以及钙网蛋白的表达，明确MRK是否引起细胞免疫原性死亡(Immunogenic cell death，ICD)；流式细胞术和激光共聚焦实验探究MR52是否促进B16F10细胞对Cy5的摄取。随后，通过动物实验探究MRK在体内的抗肿瘤作用和免疫调节作用。在小鼠黑色素瘤皮下瘤模型中瘤内注射MRK研究其对黑色素瘤的抑制作用；流式细胞术检测腹股沟引流淋巴结中树突状细胞(Dendritic cells， DC)、肿瘤中巨噬细胞和T细胞的比例以及MRK对TAMs的程序死亡配体1(Programmed death ligand 1，PD-L1)表达的影响。使用小鼠肝癌恶性腹水模型研究单独MRK或MRK联合PD-1单抗对恶性腹水的治疗效果。
　　结果：CAMKII特异性抑制剂KN93可有效抑制黑色素瘤细胞的增殖并可重塑BMDMs向M1极化。MR52呈现网状纳米纤维结构，具有直接杀伤肿瘤细胞、控制药物释放的性能。与游离的KN93相比，MRK在体外可显著提升对肿瘤细胞的杀伤效果和肿瘤细胞免疫原性死亡水平，其机制可能是MR52促进了B16F10细胞对MRK负载的KN93的摄取。体内注射MRK显著抑制皮下黑色素瘤的生长，促进引流淋巴结区DC的成熟，显著减少肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的数量，并增加细胞毒性T细胞的浸润。同时MRK处理后，巨噬细胞的PD-L1表达上调。MRK联合PD-1单抗疗法对小鼠黑色素瘤的抑制效果更加显著。在传统治疗效果欠佳的肝癌恶性腹水的小鼠模型中，与对照组相比，MRK处理组显著延长了小鼠的生存期，MRK联合PD-1单抗疗法进一步延长了小鼠生存期并产生了较高的治愈率。
　　结论：本研究中，我们创建了一种具有良好生物降解性和生物相容性的包裹KN93的蜂毒肽水凝胶MRK，其可持续递送KN93，促进肿瘤细胞对KN93的摄取。MRK在杀伤肿瘤细胞的同时重编程TAMs，改善免疫抑制性肿瘤微环境，联合PD-1单抗治疗可显著延长恶性黑色素瘤及肝癌恶性腹水小鼠生存，有望向临床转化。