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第一部分SD大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养及鉴定目的新生SD大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons, SGN)的体外原代培养及鉴定。方法出生1-3天的SD大鼠乳鼠在75%酒精中麻醉5分钟后断头,在解剖显微镜下移去双侧颞骨并打开听泡,并取出耳蜗蜗轴内组织,分离基底膜及血管纹组织,暴露螺旋神经组织。在37℃下0.25%胰酶消化螺旋神经组织30分钟并制成细胞悬液后接种于12孔板培养板,5%CO2/95%O2.37℃的培养箱中培养。SGN使用含10%神经营养因子(B27)的DMEM/F12神经细胞培养基,加入5μmol/l的阿糖胞苷纯化细胞24、48、72h后爬片,鉴定采用TUJ1(Santa Cruz, USA)和NeuN (abcam,USA)抗体,应用普通光镜和激光共聚焦免疫荧光的方法观察、鉴定培养的细胞。结果在普通光学显微镜下观察到SGN接种6小时后贴壁生长,早期细胞轴突不明显,后期形成长长的双极或三极轴突,胞体呈亮度较高的“椭圆形”(见图1-1)。采用低浓度阿糖胞苷药物能去除大部分成纤维细胞,72h纯化程度最高,螺旋细胞死亡不明显。激光共聚焦免疫荧光发现抗体主要表达在细胞膜及轴突(见图1-2,3)。结论利用胰酶消化法可以成功的进行SD大鼠乳鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养,5μmol/l阿糖胞苷纯化72h后可得到纯度较高的螺旋神经节细胞,并可以用神经细胞特异性抗体NeuN和TUJ1鉴定。第二部分模拟手机电磁辐射对正常螺旋神经节细胞损伤的研究目的研究常用手机频率1800MHz,强度SAR(2和4W/kg)下电磁辐射对螺旋神经节细胞DNA损伤、超微结构改变、自噬及ROS生成的相关研究。方法正常螺旋神经节细胞暴露于1800MHz电磁辐射系统,辐射强度分别设定为2和4W/kg,选择开5分钟关10分钟的“手机通话模式”,暴露时间为24小时。采用单个细胞电泳(彗星实验)观察电磁辐射对细胞DNA有无损伤,以H202作为阳性对照；投射电镜观察细胞超微结构改变(线粒体、细胞核、内质网等)；免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下观察自噬相关蛋白Beclinl和LC3-Ⅱ的表达。DCFH-DA试剂盒检测ROS生成。结果在2和4W/kg强度下,彗星实验结果均阴性(见图2-1)。投射电镜下线粒体、内质网、细胞核及细胞膜等结构未见明显异常(见图2-2),未见溶酶体及自噬小体。4W/kg强度下仅有LC3-Ⅱ蛋白少量表达(见图2-3)：4W/kg和H202组ROS生成量高于对照和2W/kg辐射组(p<0.05,0.01)(见图2-4)。结论短期暴露模式下模拟手机电磁辐射不能直接引起细胞DAN损伤；细胞超微结构未见显著改变;在该暴露模式下自噬作用不明显；4W/kg条件下ROS生成量高于对照和2W/kg辐射组。电磁辐射产生生物学效应的机制之一可能与ROS系统激活有关。第三部分模拟手机电磁辐射对脂多糖诱导的病理状态下SD大鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤的研究目的研究当螺旋神经节细胞处于病理状态下时,细胞对手机电磁辐射引起损伤敏感性的变化。方法螺旋神经节细胞接受不同浓度的脂多糖(0,20,40,50,100,200,400μg/ml)处理后,采用CCK-8及彗星实验(ph>13)以筛选出适宜的浓度作为辐射前细胞预处理浓度(即在该浓度下细胞活力正常,DNA未见损伤)。40μg/ml被筛选为预处理浓度。暴露于1800MHz电磁辐射系统,以2和4W/kg为辐射强度,选择开5分钟关10分钟的“手机通话模式”,暴露时间为24小时。分十个实验组：(1)对照组,(2)2W/kg(暴露和屏蔽组),(3)4W/kg(暴露和屏蔽组),(4)脂多糖40μg/ml+2W/kg(暴露和屏蔽组),(5)脂多糖40μg/ml+4W/kg(暴露和屏蔽组);(6)H202组。暴露结束后采用彗星实验检测DNA损伤情况；投射电镜检测有无超微结构改变；激光共聚焦免疫荧光检测自噬相关蛋白beclinl和LC3-Ⅱ蛋白的表达情况；荧光酶标仪检测细胞活性氧(ROS)生成量。结果通过CCK-8和彗星实验发现100μg/ml脂多糖能显著引起细胞活性下降及细胞DNA损伤有统计学意义(p<0.05),100μg/ml被认为引起DNA损伤和细胞活力受限的临界浓度(见图3-1,2)。40μg/ml脂多糖对细胞活性及DNA损伤无统计学意义(p>0.05),因此将40μg/ml作为预处理浓度。除了H202组,其余组彗星实验结果均为阴性(见图3-3)。在脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露组电镜提示超微结构改变,如线粒体空泡化、核固缩及出现自噬溶酶体、自噬小体；脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露组中电镜仅发现有少量自噬溶酶体出现(见图3-4)。在脂多糖W/kg暴露组自噬相关蛋白Beclinl和LC3-Ⅱ表达显著增加,其余组表达未见显著增加(见图3-5)。4W/kg暴露组、脂多糖40μg/ml+4W/kg暴露组及H2O2组中ROS量较对照组显著增加p<0.05,0.01)(见图3-6)。结论短期暴露模式下手机电磁辐射能量不足以直接引起细胞DNA损伤,但是在脂多糖诱导的细胞微损伤或脆弱状态下,4W/kg强度的电磁辐射引起了细胞超微结构的改变,有自噬现象出现,考虑细胞在病理状态下对电磁辐射的敏感性增加所致。这种超微结构的改变是否存在累积效应并引起耳蜗功能的改变尚需进一步研究；自噬的作用仍需要进一步的探讨。ROS的激活及在病理状态下细胞ROS清除障碍被认为是电磁辐射引起损伤的主要原因。