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酸敏感离子通道(ASICs)是一类配体门控性离子通道,在正常生理环境下,机体内环境受到PH十分精密的调节以至达到稳定。组织酸化可使PH值降至6.0以下,而酸敏感的离子通道可以感受PH值的变化。本课题组前期研究证实在佐剂性关节炎模型中,ASIC1a, ASIC2a和ASIC3表达均显著性升高,ASIC1a的激活会加剧Ca2+的内流导致关节软骨细胞损伤过程。大量文献表明,ASIC2a具有保护作用,可以降低Ca2+的内流,但ASIC2a在酸诱导的大鼠关节软骨中的作用以及具体机制尚不清楚。为此,本研究选用大鼠关节软骨细胞为研究对象,采用胞外酸化刺激模拟AA大鼠关节滑液环境,探讨ASIC2a是否在酸化诱导的关节软骨细胞凋亡中发挥作用及其作用的分子机制。目的：通过构建真核表达pEGFP-C2-ASIC2a质粒,转染大鼠关节软骨细胞,建立ASIC2a在关节软骨细胞中过表达的模型,观察ASIC2a mRNA及其蛋白在细胞中的表达。检钡ASIC2a通道不同表达水平的Ca2+内流变化以及对酸化诱导细胞凋亡的影响,并通过监测凋亡相关基因Bcl-2家族mRNA的相对表达水平,以及软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原量的变化和凋亡通路MAPK中p38和ERK1/2通路磷酸化的水平。研究酸敏感离子通道2a的过表达对酸诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡可能的作用机制。方法：从大鼠脑组织中提取目的基因ASIC2a,并用EcoRI和Kpn I进行双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒pEGFP-C2,将其酶切产物按常规方法连接并转化入大肠杆菌DH5a,挑单克隆菌进行培养,提取质粒,再通过双酶切鉴定及测序后,用Lipofectamine2000将所构建质粒转染入关节软骨细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,使用RT-PCR和Western blot法检测ASIC2a mRNA和蛋白表达,以鉴定模型建立成功与否。然后采用胞外酸化的方法建立AA大鼠关节软骨细胞凋亡体外模型,Western blot法检测ASIC2a上调后ASIC1a的表达变化,激光共聚焦技术检测[Ca2+]i水平,Annexin-V/PI流式细胞术、Hoechst33258染色法、检测各组细胞凋亡情况,免疫细胞化学技术检测软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原含量变化,q-RT-PCR检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Bcl-xl的mRNA的相对表达水平。Western blot法检测MAPK中p38和ERK1/2通路磷酸化的水平。结果：1.过表达模型构建成功：进行双酶切鉴定目的条带清晰准确,转染后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光表达,通过RT-PCR可发现mRNA转录,Western blot法可发现目的蛋白表达升高。2. ASICs亚基间的相互作用：将构建成功的过表达质粒转染入关节软骨细胞后,建立大鼠关节软骨细胞ASIC2a过表达模型,并观察ASIC2a过表达对ASIC1a表达的影响。结果表明,在酸化情况下,ASIC2a上调后ASIC1a表达下降。3.ASIC2a过表达后Ca2+内流情况以及对细胞凋亡的影响：在胞外酸化条件刺激下观察关节软骨细胞外Ca2+内流情况,发现过表达组细胞Ca2+内流幅度明显低于模型组；将过表达质粒转染入关节软骨细胞,在胞外酸化条件刺激下观察各组细胞凋亡情况,同时观察软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原含量及凋亡相关基因Bax、Bcl-2mRNA的相对表达水平。结果表明,与模型组相比,转染过表达质粒引起ASIC2a表达上调后AA大鼠关节软骨细胞凋亡明显减少,Ⅱ型胶原表达量显著增多,并且过表达组Bax较模型组明显下调,而Bcl-2、Bcl-x1.较模型组明显上调。4.ASIC2a过表达后对MAPK通路的影响：将过表达质粒转染入关节软骨细胞,在胞外酸化条件刺激下观察MAPK中p38和ERK1/2通路磷酸化的水平。结果表明,与模型组相比,过表达组p38和ERK1/2通路磷酸化水平明显降低。结论：1.ASIC2a过表达模型通过RT-PCP与Western-blot法得到验证；2.ASIC1a与ASIC2a两亚基之间可能存在拮抗作用；3.ASIC2a上调可以降低Ca2+内流,对细胞凋亡具有抑制作用以及促进Ⅱ型胶原表达量的增多；4.ASIC2a上调后可以降低MAPK通路中ERK1/2和p38磷酸化水平,推测可能是因为ASIC2a有效阻止胞外Ca2+内流,导致MAPK通路活化水平降低。