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研究背景鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤,好发于我国南方地区,其发病率占头颈部肿瘤的首位,近年来,NPC的发病率有明显上升趋势。目前对于早期患者主要采用放射治疗,对于中晚期以及复发、转移的鼻咽癌患者主要采取放射治疗结合全身化疗的治疗手段,但是在临床治疗中常出现对放化疗的抵抗性,提高放化疗的剂量虽然在一定程度上可以提高生存率,但是不同患者的耐受性不同,并且毒副作用显著,使患者生活质量明显下降,影响治疗效果的进一步提高。棉酚（gossypol）是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物,有两种旋光异构体分别为左旋棉酚[（-）-gossypol]和右旋棉酚[（+）-gossypol],按照制剂分类又可分为醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚最初是作为一种男性节育药应用于临床,近年来研究发现棉酚具有显著的抗肿瘤能力,能够对多种肿瘤细胞如前列腺癌、淋巴瘤和结肠癌等产生抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用。进一步的研究证实棉酚是抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的一种小分子抑制剂,能够特异性结合在Bcl-2/Bcl-XL的BH3位点（Bcl-2 homology domain3）,阻止其与促凋亡蛋白Bax等形成异二聚体,从而抑制Bcl-2/Bcl-XL的抗凋亡功能,发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。Bcl-2蛋白是细胞凋亡相关蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白之一,在鼻咽癌等多种肿瘤高表达,与肿瘤的发生、发展、复发以及对放化疗产生的抵抗性密切相关。目的既往国内外关于棉酚在鼻咽癌中的作用尚未报道,本实验拟利用高表达Bcl-2蛋白的人鼻咽癌细胞株CNE2为研究对象,研究并比较醋酸棉酚及左旋棉酚的增殖抑制作用和凋亡诱导作用,初步探讨其可能的作用机制,为棉酚的进一步研究及临床应用提供实验依据,奠定理论基础。方法1.采用MTT比色法研究棉酚对鼻咽癌细胞CNE2的体外增殖抑制作用。2.利用Hoechst33342/PI染色及透射电镜观察棉酚作用后CNE2细胞形态的变化。3.流式细胞仪测定棉酚作用后CNE2细胞的DNA含量以定量分析细胞凋亡率。4.流式细胞仪观察棉酚对细胞周期的调控作用。5.流式细胞仪分析棉酚对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平的影响。6.比色法研究棉酚对Caspase-3活性的影响。结果1.棉酚对CNE2细胞具有生长增殖抑制作用,并且这种作用呈时间、剂量依赖效应。10μmol/L以上的醋酸棉酚、左旋棉酚作用24h即可显著抑制CNE2细胞的生长,1μmol/L的醋酸棉酚、左旋棉酚则对细胞生长没有明显影响。醋酸棉酚作用24h、48h、72h后的IC50值分别为（45.30±1.53）μmol/L、（26.04±0.62）μmol/L、（17.54±0.75）μmol/L,左旋棉酚作用24h、48h、72h后的IC50值分别为（26.29±0.73）μmol/L、（13.30±0.51）μmol/L、（10.36±0.43）μmol/L。醋酸棉酚和左旋棉酚分别作用24h、48h、72h后,其IC50值之间的差异均具有显著性意义（P＜0.001）,由此可见,左旋棉酚比醋酸棉酚的增殖抑制作用更强。2.Hoechst33342/PI染色荧光显微镜下可见经30μmol/L醋酸棉酚、左旋棉酚作用24h后,凋亡细胞的细胞核呈现致密浓染的强蓝色荧光,而对照组中正常细胞的细胞核则呈现弥散均匀的淡蓝色荧光;透射电镜下可见凋亡细胞胞质发生浓缩,出现核碎裂,核染色质固缩、边集等特征性形态学变化,而对照组的细胞核则呈不规则形态,核仁明显,核内染色质分布不均匀。3.流式细胞仪检测到在凋亡细胞的细胞周期G0/G1期前出现了DNA亚二倍体峰,即细胞凋亡峰。本实验中,10μmol/L以上的醋酸棉酚和左旋棉酚分别作用24h后,DNA直方图上均出现了不同比例的亚二倍体峰,并且细胞凋亡率同棉酚浓度呈正相关关系。棉酚处理组（≥10μmol/L）与对照组细胞凋亡率之间的差异均有显著性意义（P＜0.05）,10μmol/L以上醋酸棉酚和左旋棉酚诱导的细胞凋亡率之间的差异也具有显著性意义（P=0.013,P=0.002,P＜0.001）,由此可见,左旋棉酚比醋酸棉酚诱导细胞凋亡的能力更强。4.醋酸棉酚、左旋棉酚作用24h后,随着浓度的增加,CNE2细胞中G0/G1期细胞数比例增加,而G2/M期、S期细胞数比例均有不同程度减少,细胞被阻滞于G0/G1期,表明棉酚对CNE2细胞具有细胞周期调控作用。5.30μmol/L醋酸棉酚、左旋棉酚作用24h后,CNE2细胞中Bcl-2蛋白表达水平较对照组分别下降至（73.03±1.98）%,（58.50±4.42）%,醋酸棉酚、左旋棉酚处理组同对照组之间的差异有显著性意义（P=0.005,P＜0.001）,醋酸棉酚、左旋棉酚两处理组之间差异也具有显著性意义（P=0.001）;而CNE2细胞中Bax蛋白表达水平较对照组分别上升至（17.43±1.08）%,（25.10±3.72）%,醋酸棉酚、左旋棉酚处理组同对照组之间的差异有显著性意义（P=0.003,P＜0.001）,醋酸棉酚、左旋棉酚两处理组之间差异也具有显著性意义（P=0.009）。醋酸棉酚、左旋棉酚Bcl-2/Bax的比值较对照组（11.52±2.77）%分别下降至（4.20±0.30）%、（2.36±0.39）%,醋酸棉酚、左旋棉酚处理组同对照组之间的差异有显著性意义（P=0.001,P＜0.001）,醋酸棉酚、左旋棉酚两处理组之间的差异则无显著性意义（P=0.206）。6.30μmol/L醋酸棉酚、左旋棉酚作用不同时间后出现了Caspase-3活性的变化。作用6h时,Caspase-3活性被激活,并且随着作用时间的延长,Caspase-3活性逐渐升高,至24h时达到高峰,分别为0h的（5.13±0.27）倍、（5.44±0.41）倍,随后活性呈下降趋势,48h时降至0h的（1.77±0.22）倍、（1.61±0.20）倍。结论本研究证实棉酚对人鼻咽癌细胞株CNE2具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与Bcl-2蛋白表达水平下调,Bax蛋白表达水平上调,Caspase-3活性的激活有关,左旋棉酚具有比醋酸棉酚更强的抗肿瘤能力。