病毒性肝炎是我国最常见的疾病之一,感染人数位居世界第一,而且近些年来,酒精性肝病和脂肪性肝病发病率也逐年增高,这些疾病都有发展成肝纤维化的可能,肝纤维化已经成为了我国的常见病、多发病。肝纤维化是肝脏对各种病因(如病毒感染、酒精滥用、胆汁淤积、代谢性疾病、自身免疫性疾病、寄生虫感染等)所引起的慢性损伤的一种反应,由多种氧化应激细胞因子和生长因子等复杂作用所产生,是各种慢性肝病向肝硬化进展的共同环节。其病理表现为肝组织内弥漫性细胞外基质尤其是胶原的过度增生与异常沉积,引起肝脏结构异常,并影响肝脏的功能。但是肝纤维化是一个可逆的病理过程,多项研究证实去除上述的各种致病因素,可以明显的减轻肝纤维化,使肝脏功能恢复正常。但是,如果致病因素没有及时去除,则会进展成为失代偿期肝硬化,而一旦发展成为肝硬化,即使进行有效地治疗,也不能恢复正常。有报道显示,肝硬化5年后有17%的患者发展成为肝癌,而10年后超过40%的患者发展为肝癌。因此,提前预防和干预肝纤维化,使其逆转或者延迟其发展,对于提高患者生活质量、改善预后有非常重要的作用。当前的很多研究已经证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活是肝纤维化发生的中心环节。各种因素通过不同方式和途径作用于肝脏中的HSCs以及纤维形成细胞,导致其生物学及功能变化,引起肝纤维化。研究认为HSCs是正常及纤维化肝脏中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要合成细胞,其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。ECM成分的维持需要ECM合成与降解保持动态平衡,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是影响ECM降解的主要因素,而它的活性主要受组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)的调节。正常情况下,HSCs能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如MMP-1、MMP-2等以降解各种ECM,同时分泌TIMP-1防止胶原过度降解,使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子家族。他们都包含CX2CX3FX5LX2HX3H这样一个与DNA结合的极端保守序列。到目前为止,KLFs家族已经发现了至少25个成员。这些因子在基因表达调控、细胞增殖、凋亡、分化、胚胎发育和体细胞重构等方面发挥着重要的作用。同时,KLFs家族在各种疾病,例如在ECM的重构中也发挥着重要的作用。人KLF4是在1998年采用包含锌指结构的DNA探针在人脐静脉内皮细胞的c DNA文库中首次发现的。KLF4有很多重要的功能,例如调节某些特定细胞的增殖和分化,并且最近的研究已经显示KLF4可以调节一些基因例如MMP-1,TGF-β在肌成纤维细胞中的表达。而我们已经知道,这些基因在ECM的重构方面发挥着重要作用。故KLF4可能对肝纤维化的发生、发展有调节作用。然而,关于KLF4在肝纤维化中的作用仍不清楚。本研究的目的主要是阐明KLF4在肝纤维化发生发展中的作用机制,为肝纤维化的防治奠定理论基础。因此,本实验在前期实验的基础上,设计合成了针对大鼠靶向KLF4的RNA干扰质粒载体以及针对人KLF4的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),筛选出沉默效果最好的干扰质粒载体以及si RNA,观察沉默KLF4表达,对大鼠HSC-T6以及人HSC-LX2细胞生物学行为的影响,并探讨KLF4沉默对两种细胞胶原代谢以及相关酶类的影响。在此基础上,进一步分析了其对TGF-β/Smad信号转导通路的作用。实验内容主要包括以下三部分:第一部分沉默KLF4表达对肝星状细胞生物学行为的影响目的:筛选有效沉默KLF4基因表达的si RNA以及干扰质粒。观察KLF4基因沉默对人肝星状细胞HSC-LX2以及大鼠肝星状细胞HSC-T6生物学特性的影响。方法:设计并化学合成针对人KLF4 m RNA 909,1332和1682位点的3对21个核苷酸(nt)的si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3),转染人肝星状细胞株HSC-LX2。以转染非特异si RNA(NC si RNA,与KLF4 m RNA无同源性的21 nt si RNA)作为阴性对照。同时,设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)以及阴性对照。提取上述两种细胞RNA,采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)方法分析KLF4 m RNA表达情况。提取两种细胞总蛋白,采用western blot的方法分析KLF4蛋白的表达情况,筛选出沉默KLF4效果最好的1个si RNA和干扰质粒。将沉默效果最好的si RNA和干扰质粒分别转染HSC-LX2和HSC-T6,然后,用MTT法检测KLF4沉默对肝星状细胞增殖的影响。采用Brd U法测定细胞DNA合成。采用ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子:转化生长因子b1(transforming growth factor,TGF-b1)、白介素1b(interleukin-1b,IL-1b)和肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)的表达情况。结果:Real-time RT-PCR结果显示3对si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3)和对照组相比KLF4 m RNA的表达分别是65.9%,60.2%和31.3%(P<0.05),其中si RNA3组对KLF4 m RNA的沉默效果最好。三条干扰载体质粒p GPU6(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)和对照组相比,KLF4m RNA的表达分别是60.1%,54.8%和28.2%(P<0.05),故p GPU6-3组对KLF4 m RNA的沉默效果最好。western blot的结果显示与内参蛋白β-actin相比,3对si RNA(si RNA1,si RNA2,si RNA3)组KLF4蛋白表达分别是61.4%,58.6%和32.2%(P<0.05)。与m RNA的结果类似,si RNA3组对KLF4蛋白的沉默效果最好。故后续试验均采用si RNA3沉默HSC-LX2的KLF4的表达。3个干扰质粒p GPU6(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)组KLF4蛋白表达分别为51.3%,47.5%和30.5%(P<0.05)。同样,p GPU6-3组对KLF4蛋白的沉默效果最好。故后续试验均采用p GPU6-3沉默HSC-T6的KLF4的表达。si RNA3转染HSC-LX2细胞后,同阴性对照组相比,MTT实验结果显示,在12h、24h和48h,细胞活力分别降为75.56%,52.35%和50.14%(P<0.05)。p GPU6-3转染HSC-T6细胞后,同阴性对照组相比,MTT实验结果显示,在12h、24h和48h,细胞活力分别降为68.94%,49.15%和45.04%(P<0.05)。根据MTT检测结果,选择转染后48h检测各组细胞DNA合成。Brd U法检测显示在HSC-LX2细胞,si RNA3组同对照组相比,DNA合成降为46.38%。在HSC-T6细胞,p GPU6-3组DNA合成降为40.21%。si RNA3转染HSC-LX2细胞48h后,ELISA结果显示与对照组比较,TGF-β1表达量下降到原来的29.21%,TNF-a表达量下降到原来的72.91%,IL-1β表达量下降到原来的51.25%。同样,p GPU6-3转染HSC-T6细胞48h后,ELISA法结果也显示与对照组比较,TGF-β1表达量下降到原来的25.76%,TNF-a表达量下降到原来的65.94%,IL-1β表达量下降到原来的46.32%。与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:筛选出可靠沉默KLF4表达的si RNA3和干扰质粒p GPU6-3。KLF4基因沉默可以影响两种肝星状细胞(HSC-LX2、HSC-T6)生物学行为,抑制两种肝星状细胞的增殖。两种肝星状细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-b1、IL-1b以及TNF-a表达量下降。第二部分沉默KLF4表达对肝星状细胞胶原蛋白代谢及相关酶类的影响目的:探讨沉默KLF4表达后,对HSC-LX2和HSC-T6细胞胶原蛋白代谢以及相关酶类的影响,为下一步机制研究奠定基础。方法:将筛选出来的沉默KLF4效果最好的si RNA3,转染人HSC-LX2细胞。沉默KLF4效果最好的干扰质粒p GPU6-3,转染大鼠HSC-T6细胞。转染24小时和48小时后分别采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法检测I型胶原、III型胶原、MMP-1、MMP-13、TIMP-1 m RNA和蛋白的表达。Real-time RT-PCR法以GAPDH为内参照,用2-△△Ct法进行分析计算。western blot的方法以β-actin蛋白为内参照,进行分析。结果:Real-time RT-PCR结果显示。si RNA3转染人HSC-LX2细胞后,I型胶原、III型胶原和TIMP-1相对于对照组的m RNA表达分别下降为31.3%,42.4%和53.2%;而MMP-1 m RNA的表达则上升为169.1%。p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,I型胶原、III型胶原和TIMP-1相对于对照组的m RNA表达分别下降为35.8%,29.8%和47.8%;而MMP-13 m RNA的表达则上升为171.2%。Western Blot检测中,si RNA3转染人HSC-LX2细胞后,以β-actin为内参照,I型胶原蛋白,III型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为37.3%,45.3%和42.1%;而MMP-1蛋白的表达则上升为85.4%。p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,以β-actin为内参照,I型胶原蛋白,III型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为32.6%,28.3%和33.1%;而MMP-13蛋白的表达则上升为127.3%。结论:KLF4基因沉默可以显著减少人HSC-LX2细胞以及大鼠HSC-T6细胞I型胶原蛋白和III胶原蛋白的表达。其机制可能是和增加MMP-1、MMP-13表达,而抑制TIMP-1的表达有关。第三部分 KLF4对TGF-β/Smad信号转导通路的作用目的:沉默KLF4在HSC-T6细胞中的表达进而对KLF4在TGF-β/Smad信号转导通路中的作用进行初步研究。方法:大鼠HSC-T6复苏后接种于含12%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基中。置于5%CO2 37℃的培养箱内。按如下分组进行试验①Control组,只用含12%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞。②TGF-β1组,在含12%胎牛血清的DMEM培养液中加入TGF-β1细胞干预液,使其终浓度为50ng/ml。③p GPU6-3组,将干扰质粒p GPU6-3转染HSC-T6细胞。④TGF-β1+p GPU6-3组,将干扰质粒p GPU6-3转染HSC-T6细胞24h后,再加入TGF-β1细胞干预液,使其终浓度为50ng/ml。Real-time RT-PCR检测HSC-T6细胞中Smad2,Smad3,Smad7及GAPDH m RNA的表达。Western blot技术检测HSCs-T6细胞中的Smad2蛋白,磷酸化的p-Smad2蛋白,Smad3蛋白,磷酸化的p-Smad3蛋白,Smad7蛋白及内参β-actin蛋白。结果:Real-time RT-PCR结果显示TGF-β1组,p GPU6-3组和TGF-β1+p GPU6-3组中Smad2相对于Control组的m RNA的表达分别是130.1%,97.6%和129.7%;三组中Smad3相对于Control组的m RNA的表达分别是121.0%,98.0%和119.7%;三组中Smad7相对于Control组的m RNA的表达分别是111.6%,157.9%和141.6%。可见,p GPU6-3组与Control组比较,Smad2和Smad3 m RNA表达无明显变化,而p GPU6-3组和TGF-β1+p GPU6-3组的Smad7 m RNA表达比Control组增多。以β-actin蛋白为对照,则Smad2蛋白在Control组,TGF-β1组,p GPU6-3组和TGF-β1+p GPU6-3组中的蛋白的表达分别是24.1%,33.5%,23.2%和32.5%。Smad3蛋白在四组中的蛋白的表达分别是33.5%,43.7%,32.5%和42.9%。与m RNA的结果类似,p GPU6-3组与Control组比较,Smad2和Smad3蛋白表达也无明显变化。而磷酸化的p-Smad2蛋白在四组中的蛋白的表达分别是73.6%,93.9%,34.4%和55.9%。磷酸化的p-Smad3蛋白在四组中的蛋白的表达分别是69.6%,98.8%,23.5%和43.0%。可以看出,p GPU6-3组和TGF-β+p GPU6-3组与Control组比较,p-Smad2和p-Smad3蛋白表达明显减少。Smad7蛋白在四组中的蛋白的表达分别是30.5%,37.1%,65.4%和51.9%,可见与m RNA的结果类似,p GPU6-3组和TGF-β1+p GPU6-3组的Smad7蛋白表达比Control组增多。第三部分KLF4对TGF-β/Smad信号转导通路的作用结论:KLF4沉默减少了Smad2和Smad3蛋白磷酸化,增加了Smad7蛋白的表达。故KLF4促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和胶原代谢,可能和其抑制TGF-β/Smad信号转导通路作用有关。