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目的经多批次基础研究证实石斛合剂具有减轻IR、降糖调脂、抗氧化损伤、降低炎症因子等多种功效。基于课题组前期研究,本实验通过体内外试验建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型并探讨自噬相关通路AMPK/mTOR-TFEB与2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的关系,观察石斛合剂对糖脂代谢及肝脏自噬的影响,以期为糖尿病合并肝损伤提供新的治疗靶点,为石斛合剂针对糖尿病肝损伤的临床治疗提供实验依据,为中医药的深入研究发展奠定一定的实验基础。方法第一部分石斛合剂对T2DM合并NAFLD大鼠糖脂代谢的影响及机制研究40只雄性SD大鼠,根据体重随机选择10只作为正常组。其余30只大鼠高脂高糖饮食喂养42d,然后腹腔注射STZ建立T2DM合并NAFLD模型。根据血糖体重随机分为模型组,二甲双胍组和石斛合剂组。每组大鼠灌胃28d,每7d测量一次体重和空腹血糖。灌胃结束后,对大鼠实施安乐死。取腹主动脉血、肝组织,检测各组大鼠血清中糖化血清蛋白(GSP)、胰岛素(INS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量;HE染色观察肝脏组织形态变化;免疫组织化学观察P-AMPK、TFEB表达情况;Western Blot检测AMPK/mTOR-TFEB信号通路相关蛋白的表达。第二部分石斛合剂含药血清对IR-脂肪变HepG2细胞模型作用及机制研究HepG2细胞,DMEM高糖培养基+10%FBS+1%青链霉素(37℃,5%CO2)培养。CCK8筛选最佳造模棕榈酸浓度及时间。采用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)对棕榈酸作用浓度及作用时间进行考察,建立稳定的IR-脂肪变HepG2细胞模型。CCK8检测石斛合剂含药血清对IR-脂肪变HepG2细胞增殖情况,确定给药浓度及时间。检测含药血清对IR-脂肪变HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响。油红O染色观察肝细胞脂肪变性程度及治疗效果。Western Blot检测石斛合剂含药血清对自噬影响以及各组细胞AMPK/mTOR-TFEB信号通路相关蛋白表达。结果第一部分在体实验1.糖代谢情况:与模型组相比,石斛合剂组与二甲双胍组大鼠的空腹血糖,糖化血清蛋白、胰岛素分泌不足情况均有显著改善(P<0.01)。2.脂代谢情况:与模型组相比,石斛合剂组与二甲双胍组大鼠血脂情况得到改善,HDL改善显著(P<0.05),TC、TG、LDL改善极显著(P<0.01)。3.肝功能AST、ALT情况:与正常对照组比较,模型对照组AST、ALT均明显上升(P<0.01),二甲双胍组与石斛合剂组仅ALT明显上升(P<0.01);与模型对照组比较,二甲双胍组与石斛合剂组AST、ALT均显著降低(P<0.01),肝功能改善明显。4.肝脏HE染色结果显示:石斛合剂与二甲双胍均能一定程度上改善T2DM合并NAFLD大鼠肝脏形态。5.免疫组织化学结果显示:P-AMPK、TFEB在模型对照组无明显表达(P<0.01);与模型组相比,正常对照组表达增加(P<0.01);二甲双胍组与石斛合剂组表达明显增加(P<0.01),多表达在血管内皮细胞中。6.Western Blot结果显示:石斛合剂与二甲双胍促进AMPK磷酸化(P<0.05),抑制mTOR(P<0.05),激活自噬,增加TFEB、LC3II(P<0.01)表达。第二部分离体实验1.250μM棕榈酸作用于HepG2细胞24 h后出现脂肪变性,且具有明显胰岛素抵抗,建模成功。2.2.5%含药血清可显著增加IR-脂肪变HepG2细胞的葡萄糖代谢(P<0.01)。3.2.5%含药血清可显著改善IR-脂肪变HepG2细胞脂肪变性情况。4.2.5%含药血清可以激活自噬,增加LC3II表达(P<0.01),降低P62表达(P<0.01)。5.Western Blot结果显示2.5%含药血清可增加P-AMPK/AMPK比值(P<0.05)、TFEB蛋白的表达(P<0.01),下调mTOR蛋白的表达(P<0.01)。结论在体、离体实验均结果表明,石斛合剂可通过激活AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路来减轻细胞脂毒性及胰岛素抵抗,改善肝脏功能及病理形态。因此,石斛合剂可能是是一种针对糖脂代谢紊乱的有前景的中药复方制剂,有待临床进一步验证。