肾透明细胞癌(RCC)约占成年患者所有恶性疾病的2-3%,而在泌尿系肿瘤中,肾癌是第三大死亡原因。在世界范围内,它是女性患者常见的癌症中占第9位,而在男性患者中占第7位。随着近些年的研究表明,肾癌的发病率和死亡率一直在上升,而其死亡率通常与这种疾病的转移性病变密切相关,而透明细胞癌是肾脏恶性肿瘤最常见的组织类型。目前研究认为,肾部分切除术或根治性肾切除术被认为是治疗肾脏透明细胞癌的最佳治疗方案,但是在切除原发肿瘤后,肾癌患者的复发率约为20–30%,且这种肿瘤如果出现转移,其五年生存率仍小于10%。舒尼替尼已被用作治疗转移性透明细胞肾细胞癌的主要疗法,因为它可以通过抑制肿瘤生长和血管生成而发挥作用。然而,由于舒尼替尼耐药性的发展,大多数肾癌细胞仍可能再生长,详细的机制仍有待进一步研究。从目前报道的关于肿瘤血管生成相关因素研究,血管生成素家族包括血管生成素-1和血管生成素-2(ANGPT-1和-2)。在中风的实验性模型中,雌二醇可通过雌激素受体α(ERα)调节ANGPT-1的表达,但不调节ANGPT-2的表达。迄今为止,还没有发现关于调节ANGPT-2与E2/ER信号通路的研究。因此,本研究探索雌激素受体β(ERβ)如何上调肾癌细胞中的ANGPT-2,以及ERβ增加的ANGPT-2如何促进血管内皮细胞管的成管形成并增加对舒尼替尼的抵抗作用。通过研究机制表明,ERβ可以通过肾癌细胞中的细胞因子ANGPT-2的转录调控作用发挥功能,同时,分泌的ANGPT-2上调可以增加血管内皮细胞的Tie-2的磷酸化,从而促进血管生成并增加舒尼替尼对血管内皮细胞的治疗敏感性。使用血管内皮细胞成管实验和小鼠主动脉环实验,临床前研究的裸鼠肾癌移植瘤模型也证实这一发现。我们以抗雌激素药物氟维司群(Faslodex)联合舒尼替尼,通过这一新的ERβ/ANGPT-2/Tie-2信号通路,可能有助于开发舒尼替尼的新型联合疗法,从而更好地抑制肾癌进展。第一部分ERβ促进血管生成和舒尼替尼抑制肾癌血管生成的作用目的:探讨肾癌细胞与血管内皮细胞共培养后,ERβ对血管内皮细胞血管生成的影响及舒尼替尼对血管内皮细胞表型的影响。方法:1.检测过表达或敲低ERβ在两种不同肾癌细胞的蛋白表达。2.共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,在肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,通过血管成管实验,检测给与不同刺激后,观察血管内皮细胞表型的变化。3.给与血管内皮细胞不同浓度舒尼替尼药物干预后,观察血管内皮细胞出现血管成管表型的变化,选择合适的舒尼替尼浓度用于后续实验。4.共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,在肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,向血管内皮细胞加入舒尼替尼,通过细胞成管实验,检测给与不同刺激后,观察血管内皮细胞表型的变化。5.动脉环实验:共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,在肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,收集两种细胞共培养后的培养基,不添加或添加舒尼替尼,观察血管动脉环出现血管突触表型的变化。6.查询数据库,统计ERβ在肾肿瘤患者的生存率及在男、女患者的生存率。结果:1.过表达或敲低ERβ在两种不同肾癌细胞的蛋白表达。目前研究表明,肾癌细胞A498内ERβ含量较低,而肾癌细胞786-O内ERβ含量较高,在肾癌细胞A498内过表达ERβ和786-O内敲低ERβ,可见ERβ蛋白的变化;2.细胞成管实验:共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,给与肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,观察血管内皮细胞表型的变化。将过表达或敲低的ERβ质粒转染至293T工具细胞后,病毒液感染肾癌细胞,与血管内皮细胞共培养72小时,取共培养的培养基与新鲜培养基进行1:1的混合后,做细胞成管实验。相对于对照组,过表达ERβ组细胞成管的数目增多(P<0.01),而敲低ERβ组细胞成管的数目减少,说明ERβ对血管内皮细胞的血管生成有显著的影响(P<0.01);3.不同浓度舒尼替尼药物对血管内皮细胞的细胞成管的影响。在选择舒尼替尼药物的浓度作为预实验时,舒尼替尼药物的浓度从DMSO,0.5μM、1μM、2μM、5μM至10μM的6个浓度,当药物浓度分别为1μM、2μM、5μM和10μM,这四个浓度时,细胞成管试验均被药物明显抑制,成管实验结果无差异(P>0.05),当药物浓度在0.5μM和1μM时,细胞成管实验结果有统计学差异(P<0.05)。因此,在后续的实验中,我们所选用舒尼替尼药物浓度均为1μM;4.细胞成管实验:共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,给与肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,同时,向血管内皮细胞加入舒尼替尼药物,观察血管内皮细胞表型的变化。将过表达或敲低的ERβ质粒转染至293T工具细胞后,病毒液感染肾癌细胞,与血管内皮细胞共培养72小时,取共培养的培养基与新鲜培养基进行1:1混合后,向预混合好的培养基内添加1μM舒尼替尼药物。相对于对照组,过表达ERβ组细胞成管的数目增多(P<0.001),而敲低ERβ组细胞成管的数目减少,说明ERβ对血管内皮细胞的细胞成管有显著的影响(P<0.05);5.动脉环实验:共培养肾癌细胞和血管内皮细胞,在肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,收集两种细胞共培养后的培养基,不添加或添加舒尼替尼药物,观察血管动脉环出现血管突触表型的变化。将过表达或敲低的ERβ质粒转染至293T工具细胞后,病毒液感染肾癌细胞,与血管内皮细胞共培养72小时,取共培养的培养基与新鲜培养基进行1:1混合,向预混合好的培养基内不添加或添加舒尼替尼药物,用来做动脉环实验,在7-9天内观察血管形成突触的数目。相对于对照组,未添加舒尼替尼药物的过表达ERβ组血管突触的数目增多(P<0.01),而未添加舒尼替尼药物的敲低ERβ组血管突触的数目减少,说明ERβ对小鼠动脉环的血管突触的生成有显著的影响(P<0.05);相对于对照组,添加20 n M的舒尼替尼药物的过表达ERβ组血管突触的数目增多(P<0.001),而添加20n M的舒尼替尼药物的敲低ERβ组血管突触的数目减少,说明过表达或敲低ERβ后,添加舒尼替尼对小鼠动脉环的血管突触有统计学差异(P<0.01);6.查询数据库,E Rβ在肾肿瘤患者的生存率及在男、女患者的生存率。随着时间的延长,相对于低表达ERβ的患者而言,高表达ERβ患者在所有肾癌患者中的生存率较差,差异有统计学意义(P<0.001);相对于低表达ERβ的男性患者而言,高表达ERβ的男性肾癌患者的生存率较低,差异有统计学意义(P=0.007);相对于低表达ERβ的女性患者而言,高表达ERβ的女性肾癌患者的生存率较低,差异有统计学意义(P=0.012)。因此,上述数据可表明,在肾癌患者的生存率中,高表达ERβ患者比低表达ERβ患者的生存率低,预后差。结论:1.ERβ在肾癌细胞能够促进血管生成,增加对舒尼替尼药物的抵抗性。2.通过数据库的研究表明,在肾癌患者的生存期,高表达ERβ比低表达ERβ的患者生存率要低,预后差。第二部分ERβ靶向调控Angiopoietin-2/Tie-2信号通路在肾癌血管生成的机制研究目的:探讨肾癌细胞与血管内皮细胞共培养后,ERβ调节Angiopoiet in-2/Tie-2的信号通路传导途径和血管生成变化。方法:1.检测两个不同序列的敲低ERβ在肾癌细胞786-O的蛋白表达,同时,将两个敲低ERβ的病毒液转染至786-O细胞内,与血管内皮细胞共培养后,不添加或添加1μM舒尼替尼药物,观察细胞表型的变化。2.在肾癌细胞内过表达或敲低ERβ后,通过q RT-PCR检测有意义的相关血管生成的基因。3.在第三株肾癌细胞系内Caki-1敲低ERβ,通过q RT-PCR检测下游基因的改变,同时验证敲低ERβ在肾癌细胞内的蛋白变化。4.筛选出下游基因HGF和ANGPT-2,将其敲低后转染至肾癌细胞,与血管内皮细胞共培养后,观察细胞表型的变化,通过数据库,明确AN GPT-2基因在肾癌细胞内表达高低对患者生存率的影响。5.检测过表达和敲低ERβ,在A498和786-O细胞内,ERβ和ANGPT-2的蛋白表达。6.使用过表达ERβ和敲低ANGPT-2的质粒转染到A498细胞内和使用敲低ERβ和过表达ANGPT-2的质粒转染到786-O细胞内,分别检测在肾癌细胞内和血管内皮细胞内蛋白的变化;检测未添加和添加舒尼替尼药物后,血管内皮细胞发生表型的变化。7.查找数据库,研究ERβ在肾癌细胞内如何调控下游基因ANGPT-2。8.使用q RT-PCR方法,检测ANGPT-1和ANGPT-2在肾癌细胞内A498和786-O的含量,同时检测ANGPT-2在肾癌细胞786-O,Caki-1、A498和血管内皮细胞内的蛋白含量。结果:1.选择两个不同序列的敲低ERβ用于蛋白表达的检测和表型变化。两个不同序列的敲低ERβ在肾癌细胞786-O的蛋白表达,相对于对照组,未添加或者添加舒尼替尼药物的两个不同序列敲低的ERβ组,其细胞成管数目均减少(*P<0.05;**P<0.01),而在两个不同序列的敲低ERβ,在肾癌细胞与血管内皮细胞共培养后,细胞成管的数目没有统计学差异(P>0.05)。而通过蛋白表达和细胞成管数目的减少程度来看,选择第一个敲低的ERβ序列用于后续的实验;2.查找数据库,使用q RT-PCR方法检测与肾癌相关的基因。在肾癌786-O细胞内,进行敲低ERβ,使用q RT-PCR方法检测有变化的基因有ANGPT-2、b FGF、HBEGF、HGF、LEP、VEGFA;在肾癌A498细胞内,进行过表达ERβ,使用q RT-PCR方法检测有变化的基因有ANGPT-2、HGF;3.在肾癌细胞Caki-1内进行敲低ERβ,检测q RT-PCR和ERβ的变化。在第三株肾癌细胞系内Caki-1敲低ERβ,通过q RT-PCR检测下游基因的改变,发现ANGPT-2和HGF两个基因的q RT-PCR有变化,同时验证敲低ERβ在肾癌细胞Caki-1的蛋白可降低;4.敲低HGF和ANGPT-2两个下游基因,观察血管内皮细胞成管的表型变化,及通过数据库得出下游基因在肾肿瘤患者的生存率。通过上述研究,筛选出下游基因HGF和ANGPT-2,将其敲低后转染至肾癌细胞内,与血管内皮细胞共培养后,观察细胞表型的变化。与对照组相比,敲低的HGF转染至肾癌细胞内,所形成的细胞生成数目没有统计学差异(P>0.05);与对照组相比,敲低的ANGPT-2转染至肾癌细胞内,所形成的细胞生成数目有差异,结果有统计学意义(P<0.001)。通过数据库分析,高表达和者低表达ANGPT-2基因在肾癌细胞对患者的生存率没有统计学差异(P=0.26);5.检测过表达或敲低ERβ在肾癌细胞内,ERβ和ANGPT-2的蛋白水平变化。在肾癌细胞A498内,过表达ERβ后,可见肾癌细胞内ERβ和ANGPT-2的蛋白表达均升高;而在肾癌细胞786-O内,敲低ERβ后,可见肾癌细胞内ERβ和ANGPT-2的蛋白表达均降低;6.在肾癌细胞A498和786-O内,进行过表达ERβ、敲低ANGPT-2和敲低ERβ、过表达ANGPT-2后,可见细胞成管数目的变化和在两种细胞内蛋白表达的变化。使用过表达ERβ和敲低ANGPT-2的质粒转染至A498细胞内,检测肾癌细胞ANGPT-2蛋白的变化,可见过表达ERβ的蛋白增加,敲低ANGPT-2的蛋白降低,同时加入过表达ERβ和敲低ANGPT-2后,蛋白表达量可被逆转。血管内皮细胞ANGPT-2和Tie-2磷酸化蛋白的变化,过表达ERβ组的ANGPT-2和Tie-2磷酸化的蛋白表达增加,敲低ANGPT-2蛋白组的ANGPT-2和Tie-2磷酸化的蛋白表达降低,同时加入过表达ERβ和敲低ANGPT-2后,蛋白表达量可被逆转。使用过表达ERβ和敲低ANGPT-2的质粒转染至在A498细胞内,与血管内皮细胞共培养后,添加或不添加舒尼替尼药物,可见过表达ERβ组增加细胞成管的数目,而敲低ANGPT-2可减少细胞成管数目减少,同时加入过表达ERβ和敲低ANGPT-2后,可见血管内皮细胞成管数目被逆转,差异有统计学意义(*P<0.05;**P<0.01)。在肾癌细胞786-O内,使用敲低ERβ和过表达的ANGPT-2的质粒转染至在786-O细胞内,蛋白表达和血管成管数目的变化均有变化,差异有统计学差异(*P<0.05;**P<0.01);7.查找数据库,明确ERβ在肾癌细胞内通过转录水平调节下游基因ANGPT-2。通过数据库,找到ERβ结合ANGPT-2的ERE区,一共有6个,通过Chip实验,检测ERE#1、ERE#2、ERE#3、ERE#4、ERE#5和ERE#6的结合部位,得出ERE#5是其结合部位,并进行转录调控。将结合部位的野生型,通过Bam H1酶酶切后变为突变型。将野生型和突变型的质粒分别转染到肾癌细胞A498和786-O细胞内,野生型质粒在A498和786-O细胞内调节有变化,差异统计学意义(P<0.01);而突变型质粒在A498和786-O细胞内调节没有变化,差异无统计学意义(P>0.05)。由此得出,ERβ能够通过转录调控,直接调控下游基因ANGPT-2;8.使用q RT-PCR方法,检测ANGPT-1和2中的m RNA在肾癌细胞内的含量,检测ANGPT-2在肾癌细胞内和血管内皮细胞内的蛋白含量。在786-O和A498细胞内,ANGPT-2的m RNA含量远远高于ANGPT-1的m RNA含量。而血管内皮细胞ANGPT-2蛋白含量远远低于三种肾癌细胞的蛋白含量。结论:在肾癌细胞内,ERβ通过转录调控Angiopoietin-2,分泌ANGPT-2作用于血管内皮细胞的Tie-2信号通路,以此介导在肾癌血管生成及舒尼替尼药物抵抗作用的机制。第三部分抗雌激素药物氟维司群联合舒尼替尼靶向抑制肾癌ERβ/Angiopoietin-2/Tie-2信号通路和动物实验目的:探讨肾癌细胞与血管内皮细胞共培养后,使用抗雌激素药物氟维司群联合舒尼替尼抑制肾癌ERβ/Angiopoietin-2/Tie-2信号介导血管生成和动物实验。方法:1.在肾癌细胞786-O,添加雌激素和雌激素抑制剂后,检测肾癌细胞和血管内皮细胞的蛋白表达,同时,在未添加或添加舒尼替尼药物后,检测血管内皮细胞成管的表型变化。2.在肾癌细胞786-O和Caki-1,添加过表达ANGPT-2和雌激素抑制剂后,检测肾癌细胞和血管内皮细胞的蛋白表达,同时,在未添加或添加舒尼替尼药物后,检测血管内皮细胞成管的表型变化。3.动物实验模型分为4组:空白组;雌激素抑制剂组;舒尼替尼组;雌激素抑制剂+舒尼替尼组。小鼠肾被膜下注射肿瘤,14天后小鼠腹腔注射雌激素抑制剂和/或舒尼替尼药物,4周后处死小鼠,检查有无肿瘤转移,检测各组肿瘤的大小、长度,及肿瘤组织切片中的免疫组化结果。结果:1.在肾癌细胞786-O,添加雌激素和雌激素抑制剂后,检测到细胞内蛋白水平和血管内皮细胞成管表型的变化。在肾癌细胞786-O内,添加雌激素和雌激素抑制剂后,可见雌激素可增加肾癌细胞和血管内皮细胞的ANGPT-2和Tie-2的磷酸化表达,增加血管内皮细胞的成管数目,而雌激素抑制剂减少肾癌细胞和血管内皮细胞的ANGPT-2和Tie-2的磷酸化表达,减少血管内皮细胞的成管数目,给与雌激素和雌激素抑制剂,与肾癌细胞的血管生成有相关性,差异有统计学差异(*,P<0.05;**,P<0.01);2.在肾癌细胞786-O和Caki-1,添加过表达ANGPT-2和雌激素抑制剂后,添加或未添加舒尼替尼药物,可见细胞蛋白水平和细胞成管的变化。在肾癌细胞786-O和Caki-1内,添加过表达ANGPT-2和雌激素抑制剂后,添加或未添加舒尼替尼药物,可见过表达ANGPT-2可增加肾癌细胞和血管内皮细胞的ANGPT-2和Tie-2的磷酸化表达,同时增加血管内皮细胞的成管数目,而雌激素抑制剂减少肾癌细胞和血管内皮细胞的ANGPT-2和Tie-2的磷酸化表达,同时减少血管内皮细胞成管数目,如同时添加过表达ANGPT-2和雌激素抑制剂,雌激素抑制剂能够部分逆转ANGPT-2的功能,同时给与过表达ANGPT-2和雌激素抑制剂,与肾癌细胞的血管生成有相关性,差异有统计学差异(*,P<0.05;**,P<0.01,***,P<0.001);3.动物模型实验表明,雌激素抑制剂联合舒尼替尼药物能够更好的抑制肿瘤的生长。将小鼠随机分为4组:1.空白组;2.雌激素抑制剂组;3.舒尼替尼组;4.雌激素抑制剂+舒尼替尼组。肾脏被膜下注射肿瘤后,14天后注射雌激素抑制剂和/或舒尼替尼药物,4周后处死小鼠,通过IVIS结果检测体内转移瘤,肿瘤的长度,肿瘤的重量及肿瘤标本的病理切片。相对于对照组而言,单纯雌激素抑制剂组和单纯舒尼替尼组能够抑制肿瘤的生长,而雌激素抑制剂联合舒尼替尼组要比其它两组有更好的抑制肿瘤的作用。结论:1.在肾癌细胞内,雌激素抑制剂联合舒尼替尼增加抑制血管生成的作用。2.在动物实验内,雌激素抑制剂和舒尼替尼均有抑制肾肿瘤血管生成的能力,而联合雌激素抑制剂和舒尼替尼药物能够更好的抑制肿瘤血管的生长。