前言神经胶质瘤是最常见的脑肿瘤，其发病率逐年增加，且病死率高。脑肿瘤患者所面对的问题之一是脑血管的不通透性，血脑屏障（the blood-brain barrier，BBB）限制亲水性化疗药物到达肿瘤。因此，如何选择性开放血肿瘤屏障成为提高胶质瘤患者化疗效果的关键因素。缓激肽（bradykinin，BK）是近年发现的可选择性开放血肿瘤屏障（theblood-tumor barrier，BTB）的药物。研究发现，将缓激肽B₂受体激动剂cereport与卡铂联合作用于脑组织可选择性开放BTB，并在临床Ⅱ期试验中得到了证实。但cereport激活的B₂受体对BBB通透性的调节具有高度敏感性和自身调节性。Cereport引起BBB短暂开放（15min），仅允许1kDa的分子通透。这就限制了抗肿瘤药物的应用类型及持续作用时间。最近的研究发现，颈内动脉灌注罂粟碱（papaverine，PA）同样可以选择性开放BTB。对缓激肽和罂粟碱的作用机制进行研究发现，它们均可引起第二信使cGMP增加。我们推测，缓激肽和罂粟碱可能通过某些相同的途径引起BTB通透性增加，两药伍用具有协同效应。研究表明，紧密连接（tight junction，TJ）是保持BBB完整性的重要因素。TJ构成了离子与分子通过细胞旁途径跨膜转运屏障的主要因素。Claudin-5是脑微血管内皮细胞TJ中的主要黏附分子，其表达水平下调可以直接导致脑微血管内皮细胞间TJ的破坏，claudin-5是TJ形成的充要条件。本研究应用大鼠胶质瘤模型，将缓激肽与罂粟碱进行伍用，观察其BTB通透性的变化，并检测TJ相关蛋白claudin-5在缓激肽与罂粟碱伍用开放BTB时表达的改变，初步明确缓激肽与罂粟碱伍用开放BTB的机制，为中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。材料和方法一、实验材料1、实验动物：本研究采用中国医科大学实验动物中心提供的Wister大鼠230只，均为雌性，体重在180～200g。2、实验细胞株：大鼠C6胶质瘤细胞株（由中国医科大学细胞生物实验室提供）。3、主要试剂：山羊抗鼠claudin-5抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；缓激肽购于美国Sigma Chemical公司；SABC试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德公司；伊文思蓝（Evans blue，EB）购自Fluka公司进口分装；盐酸罂粟碱购自沈阳第一制药厂。4、主要仪器：二氧化碳培养箱；超净工作台；大鼠脑立体定向仪；PurfusorCompact S型微量输液泵；低温冷冻离心机；紫外分光光度计；通用电泳仪：-80℃深低温冰箱；恒温冷冻切片机；Molic Images Advanced 3．2图像分析系统。二、实验方法1、建立大鼠C6胶质瘤模型。2、实验动物分组：BK与PA不同时间点伍用3、测定BTB的通透性。4、Western Blot法测定TJ相关蛋白claudin-5的表达。5、免疫组化SABC染色法观察TJ相关蛋白claudin-5的分布位置以及表达水平的变化。6、图像分析Western blot结果用Chemi Imager 5500 V2．03软件进行扫描，用FluorChen 2．0软件进行定量分析测得IDV值。免疫组化染色结果用Motic Images Advanced 3．2实时图像分析系统采集照片并进行半定量分析。7、统计学分析数据以均数±标准差（（?）±S）表示，采用SPSS11．0统计软件进行单因素方差分析和回归分析，t检验，P<0．05为差异有统计学意义。实验结果一、BTB通透性的变化BK与PA伍用的最佳时间点为BK 15min+PA60min。不同剂量伍用时，与对照组EB含量0．266±0．036μg／g脑重量（n=10）相比，各实验组EB含量分别为0．497±0．040μg／g脑重量（PA，n=10，p<0．01），0．563±0．058μg／g脑重量（BK，n=10，p<0．01），1．004±0．023μg/g脑重量（PA+BK，n=10，p<0．01），0．734±0．045μg／g脑重量（1／2PA+BK，n=10，p<0．01），0．724±0．028μg／g脑重量（PA+1／2BK，n=10，p<0．01），0．515±0．064μg/g脑重量（1／2PA+1／2BK，n=10，p<0．01）；PA+BK、1／2PA+BK、PA+1／2BK与单独应用两药相比，均具有显著差异，p<0．01。二、Western Blot法测定TJ相关蛋白clandin-5的表达变化对照组claudin-5 IDV值相对于内对照β-actin的IDV值为0．397±0．009（n=8）。与对照组相比，各实验组该比值分别为0．327±0．011（PA，n=8，p<0．01）；0．320±0．013（BK，n=8，p<0．01）；0．227±0．015（PA+BK，n=8，p<0．01）；0．262±0．019（1／2 PA+BK，n=8，p<0．01）；0．277±0．011（PA+1／2BK，n=8，p<0．01）；0．312±0．042（1／2PA+1/2BK，n=8，p<0．01）；同时将各伍用组与单独应用PA或BK相比，发现PA+BK、1／2PA+BK、PA+1/2BK三组均具有显著性差异（p<0．01）。三、免疫组化SABC染色法观察TJ相关蛋白clandin-5的分布及表达水平的变化给药前可见棕黄色免疫阳性颗粒，主要表达在肿瘤血管内皮细胞上，呈点状或线状分布。给予PA或BK后，claudin-5表达减少，其表达趋势与Western blot结果一致。各实验组平均光密度值与对照组相比均有显著性下降（p<0．01）；其中PA+BK、1／2PA+BK、PA+1／2BK三组与单独应用PA或BK相比具有显著性差异（p<0．01）。各组平均光密度值分别为0．277±0．011（对照，n=8），0．249±0．010（PA，n=8），0．243±0．007（BK，n=8），0．213±0．017（PA+BK，n=8），0．218±0．014，（1／2 PA+BK n=8），0．224±0．017（PA+1／2 BK，n=8），0．252±0．013（1／2PA+1／2 BK，n=8）。四、BTB通透性的变化与TJ相关蛋白claudin-5表达水平变化的相关性分析上述研究结果表明，缓激肽与罂粟碱均可使BTB通透性增加，两者伍用可使通透性增加更为显著：同时发现PA+BK伍用组claudin-5表达水平达到最低，随着BTB通透性的下降，claudin-5的表达水平逐渐升高，回归分析结果显示，TJ相关蛋白claudin-5表达水平变化与BTB通透性的变化呈显著负相关关系，y=0．4441-0．2293x，r=0．977，P<0．01。讨论本研究利用大鼠C6胶质瘤模型首次证明了缓激肽与罂粟碱伍用在选择性增加BTB通透性上存在协同效应，缓激肽和罂粟碱单独使用均引起TJ相关蛋白elaudin-5表达减少，两者伍用使其表达水平进一步显著下降，claudin-5的表达水平与BTB通透性的变化呈显著负相关。缓激肽及其类似物cereport是目前研究较多的选择性、可逆性开放的BTB的药物。研究表明，缓激肽选择性开放BTB的机制涉及B₂受体以及Ca²⁺内流、NO、cAMP和cGMP等多种第二信使。由于缓激肽可诱发快速耐受性而在一定程度上降低了其在临床上的应用。罂粟碱是临床上常用的血管扩张剂，利用其强大的扩血管作用，可使BBB开放。现在认为，它通过抑制平滑肌细胞上磷酸二酯酶活性并使细胞内cAMP和cGMP的增加而发挥作用。缓激肽与罂粟碱开放BBB的作用途径中出现相同的第二信使，据此我们推测，两药可能最终通过某些相同的途径发挥作用，并具有协同效应。我们通过对不同剂量的缓激肽与罂粟碱进行伍用，观察BTB开放程度发现，两药伍用与单独应用相比，BTB开放程度显著增加。研究表明，TJ是保持BBB完整性的重要因素。TJ构成了离子与分子通过细胞旁途径跨膜转运的主要屏障。目前认为，TJ由一组分子蛋白元件所构成，如：claudins，occludin等。其中claudin-5是脑微血管内皮细胞TJ中的特异性蛋白。有研究表明，claudin-5是TJ形成的充要条件。胶质瘤患者BBB通透性与claudin-5表达减少密切相关，这与本研究结果一致。本研究中，缓激肽和罂粟碱均可引起肿瘤血管内皮细胞claudin-5表达减少，两药伍用使其表达水平进一步下降，claudin-5表达水平与BTB的开放程度之间存在负相关关系，提示claudin-5是两药共同的作用靶点之一，进而引起TJ开放，BTB通透性增加，参与协同效应的产生。Liu L B等研究证明，缓激肽可通过下调TJ蛋白occludin、claudin-5和ZO-1的表达水平，使BTB通透性增加，这与我们的研究结果一致。罂粟碱通过抑制磷酸二酯酶活性使细胞内cAMP和cGMP增加。Ishizaki等研究证明，cAMP可以通过依赖或非依赖蛋白激酶A途径，导致苏氨酸磷酸化而上调猪BBB上claudin-5的表达，从而促进内皮细胞上TJ的功能。Oak Z等研究发现，毛细血管周围cGMP增多能引起BBB通透性增加。Shinji Fukui等也发现，cGMP类似物能够明显增加BBB的通透性。同样，细胞内cGMP水平增高可使肿瘤微血管的通透性增强。由此可见，缓激肽和罂粟碱下调claudin-5的表达水平可能是通过cGMP增加和／或cAMP减少介导的信号途径来实现的。本研究证明了缓激肽和罂粟碱伍用在选择性增加BTB通透性上存在着协同效应，并且初步证明了这种作用与TJ相关蛋白claudin-5的表达水平显著下调有关。研究结果提示，临床上可考虑将缓激肽和罂粟碱伍用以进一步增加进入肿瘤组织的药物浓度，本研究为临床上脑肿瘤的治疗提供了新途径。结论1、缓激肽与罂粟碱伍用在选择性增加BTB通透性上存在协同效应。2、TJ相关蛋白claudin-5表达减少是缓激肽和罂粟碱增加BTB通透性的主要因素之一，两药伍用时claudin-5的表达水平与BTB开放程度呈显著负相关。