目的：1、克隆构建GFP/Akt表达载体及鉴定,MSCs的分离培养及鉴定;2、通过脂质体真核细胞转染法,荧光显微镜下观察GFP/Akt表达载体在鼠MSCs中的表达和定位及其对VEGFmRNA和蛋白表达的影响;3、转染GFP/Akt的MSCs对下肢缺血大鼠血管生成的影响。　　 方法：　　 一、材料　　 Wistar大鼠[SCXK(辽)2003-0009],4周～6周、体重150～200g(购自中国医科大学动物试验中心)。　　 二、方法　　 1、克隆构建GFP/Akt表达载体及鉴定GFP-Akt primer设计F5'-CGAGGAATTCGATGAACGACGTAGCCATTGT-3'(含EcoRI位点)R5'-TATCAGGATCCACCTCAGGCTGTGCCACTGG-3'(含BamHI位点)。　　 Akt基因PCR扩增:以pcDNA3-Akt为模板PCR扩增此基因的开放阅读框架,引物上游引入EcoR I酶切位点,下游引入BamHI酶切位点。　　 反应体系如下:DW72.5μl,10×pyrobest buffer电泳液100μl。　　 反应条件:94℃3min,94℃50s,60℃lmin,72℃3min,72℃10min,4℃ store,30cycles。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证,在约1400bp处有明显条带,将其回收。酶切,连接,转化,质粒提取,过夜培养,次日小量提取质粒,同时保存菌种。　　 pCDNA-Akt片断扩增鉴定:Rt-PCR产物进行1％琼脂糖电泳验证,在约1450bp处为一单一条带,跟目的片段大小位置一致。　　 重组质粒酶切鉴定;取2μl质粒进行双酶切鉴定。经1％琼脂糖电泳验证,6个菌落经鉴定正确,在约4700bp处有GFP载体的酶切片段,1450bp处有Akt的酶切片段。次日大量提取质粒。　　 浓度检测:根据OD值GFP浓度是0.85μg/μl,GFP-Akt浓度是1.874μg/μl。　　 2、MSCs分离培养及鉴定将Wistar大鼠(4周～6周、体重150～200g),颈椎脱臼处死,75％酒精浸泡1分钟消毒,无菌条件下取出股骨及胫骨,剪去骨两端,用6ml肝素化(100U/ml)PBS(PH7.40)冲洗骨髓腔,将冲洗液缓缓加于Percoll(比重1.074g/ml和1.070g/ml)分离液上梯度离心(500g,20mins)后,吸取界面层细胞,用10mlPBS将其吹打制成细胞悬液洗涤(100g,10min)后弃上清,共两次。用含15％FBS的L-DMEM培养液10ml将获得的细胞吹打制成悬液接种于25cm2塑料培养瓶中,在37℃、5％CO2条件下于孵育箱中培养,3天后半量换液以后每隔2～3d全量换液以弃除悬浮,以后培养和传代按细胞培养常规。　　 3、脂质体真核细胞转染取第二代细胞(Passage2,P2)1.0～2.0×104传至24孔板上,待细胞长至80％～90％融合,分对照组、转染GFP组和转染GFP-Akt组三组(每组8孔),按Lipofectamine TM2000转染试剂说明方法,次日全部换液:对照组换含15％FBS的L-DMEM,转染GFP组及转染GFP-Akt组换含加入G418(400μg/μl)的15％FBS的L-DMEM,三天换液一次,维持筛选作用。两周后,转染细胞单克隆形成,其间荧光显微镜观察稳定转染效率并照相(取同一视野倒置相差显微镜和荧光显微镜观察转染效率:GFP组转染率为7.64％、GFP-Akt组转染率为6.5％)。　　 4、实验大鼠分组,双下肢缺血大鼠模型的制备及处理Wistar大鼠30只,鼠龄8～10周,体重150-250g;动物随机分为3组:基因治疗组,非基因治疗组,对照组。大鼠用1％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,自其腹股沟韧带中点到膝关节上做一纵型切口,分别离断双侧的股动脉及其分支。基因治疗组、非基因治疗组、对照组左侧内收肌,腓肠肌取7个点分别共肌注1.0×107pEGFP-C1/AKT转染的MSCs,1.0×107MSCs,PBS;右侧分别肌注PBS、PBS、生理盐水做对照。　　 5、动脉照影　　 实验动物分别于术后第4周在DSA下肢动脉造影,穿刺腹主动脉推注70％泛影葡胺连续摄片,对照观察双下肢血管分布密度。　　 6、毛细血管密度的测定处死动物分别取其左侧的内收肌和半膜肌标本,以10％的甲醛固定,兔抗人F-Ⅷ及CD34抗体染血管内皮细胞,苏木素复染,中性树胶封片。光镜观察血管内皮细胞里棕黄色。每个标本随机取10个视野,在高倍镜(400倍)下观察,计算毛细血管密度(毛细血管数/高倍镜)。　　 7、RT-PCR检测AKTmRNA的表达(1)分别取1.0×107细胞用RNA提取试剂Trizol提取总RNA。　　 紫外分光光度计测样品浓度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,用MMLV第一链CDNA合成试剂盒反转录合成CDNA,按说明书操作。　　 取反转录产物4μl进行PCR反应:　　 95℃预变性2 min94℃变性1min55℃复性1min72℃延伸1min,32个循环72℃延伸1min,32个循环,72℃延伸10min内对照:β-actin(上游5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3',下游5'-CCAGGAT-AGAGCCACCAAT-3')长度681bp(退火温度57℃,循环30次);VEGF(上游5'-GCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3',下游5'-TAACTCAAGCTGCCTCGCC-3')长度505bp(退火温度55℃,循环30次);Akt(上游5'-GAGGAGCGGGAAGAGTG-3',下游5'-GAGACAGGTGGAAGAAGAGC-3')长度672bp(退火温度54℃,循环30次)。　　 PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色显色,凝胶图像分析系统分析,以Akt mRNA和VEGFmRNA分别与β-actin mRNA灰度比值作为Akt mRNA及VEGFmRNA半定量指标。　　 (2)取约100mg组织,Trizole液提取总RNA总RNA提取操作均按说明书进行。　　 紫外分光光度计(A260/A280)检测RNA纯度。　　 逆转录反应:　　 总RNA1μl,Oligo dT-Adaptor primer1μl,70℃5min,水浴2min,按顺序加入10×RNAPCR缓冲液2μl、10mmol/L Dntp mixture2μl、RNA酶抑制剂20U、反转录酶1μl等,加去离子水至20μl。30℃10min;50℃30min;99℃5min;5℃5min水浴1-2min。逆转录合成的cDNA在-20℃保存用于PCR,以下操作同上。　　 8、Western blot法(1)分别取1.0×107细胞,细胞裂解液裂解细胞,蛋白抽提上样,进行10％SDS-PAGF电泳,半干法电转移法100V恒压电泳1.5h将蛋白转印到PVDF膜上。室温下用TBS阻断1h;5％脱脂奶粉封闭1h后加一抗(工作浓度1:400),37℃,2h,洗膜;加入二抗(生物素化山羊抗兔TgG抗体,工作浓度1:400),37℃,2h,洗膜;DAB显色,照相。Western blot条带图像存入计算机,用Quantity One图像分析软件包进行光密度计算。　　 (2)剪碎约100mg内收肌组织,机械匀浆,离心10min。考马斯亮蓝R250染色法测总蛋白质浓度,将各组浓度调到同一水平以下操作同上。　　 三、统计学处理应用SPSS12.10统计软件包进行数据处理,不同组间分析采用方差分析(ANOVA)检验,有显著意义后用最小有意义差异t检验进行均数间的多重比较,以P＜0.05为统计学上有显著差异。　　 结果：　　 一、MSCs的分离、培养及鉴定MSCs培养5-7 d长满瓶底,此时细胞呈平行或漩涡状生长,多次传代融合生长时,有更均匀有序的成纤维细胞样分布。CD29、CD44和CD71免疫细胞化学染色均可见棕黄色颗粒沉积于胞膜,而CD34免疫细胞化学染色后未见棕黄色颗粒沉积于胞膜。　　 二、重组质粒的鉴定和转染pEGFP-C1/Akt重组质粒酶切片段分别显现在4700bp和1450bp处,与扩增的pEGFP-C1和Akt目的片断相符。　　 三、GFP/AKT组、GFP组转染MSCs后AKTmRNA及蛋白与VEGFmRNA及蛋白的相关性GFP/AKT组、GFP组转染MSCs后VEGF蛋白和Akt蛋白表达显著正相关,VEGF mRNA和Akt mRNA表达亦正相关。　　 四、转染GFP/AKT的MSCs、MsCs对下肢缺血大鼠血管生成的相关性移植后第28 d腹主动脉造影显示,基因治疗组结扎股动脉处的远端毛细血管生成较明显,血管成网状,优于非基因治疗组及对照组。　　 结论：　　 1、MSCs分离、培养成功。　　 2、GFP/AKT重组质粒的构建、转染成功。　　 3、转染GFP/AKT的MSCs组AKTmRNA及蛋白与VEGFmRNA及蛋白高于转染GFP的MSCs组。　　 4、转染GFP/AKT的MSCs组对下肢缺血大鼠的血管生成高于MSCs组。