【摘 要】
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细粒棘球蚴病在我国高发流行,犬作为传播的核心传染源,缺乏有效的接种疫苗,关键原因在于缺乏明确功能的疫苗靶基因。我们通过差异显示法和基因组学研究细粒棘球绦虫不同发育阶段的虫体,发现EgM9基因是细粒棘球绦虫成虫成熟阶段的特异基因,尤其在体表和睾丸中高表达。用EgM9原核表达抗原接种犬后虫体数量明显减少且抑制虫体发育,提示EgM9可能是虫体发育尤其是睾丸发育的关键基因,影响精子的产生。目前在Gen B
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“细粒棘球绦虫成虫特异基因EgM9在成虫睾丸发育及产卵中的功能研究”（项目编号:32060802）,主持人:张壮志研究员,国家动物包虫病参考实验室,新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）；
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细粒棘球蚴病在我国高发流行,犬作为传播的核心传染源,缺乏有效的接种疫苗,关键原因在于缺乏明确功能的疫苗靶基因。我们通过差异显示法和基因组学研究细粒棘球绦虫不同发育阶段的虫体,发现EgM9基因是细粒棘球绦虫成虫成熟阶段的特异基因,尤其在体表和睾丸中高表达。用EgM9原核表达抗原接种犬后虫体数量明显减少且抑制虫体发育,提示EgM9可能是虫体发育尤其是睾丸发育的关键基因,影响精子的产生。目前在Gen Bank中还没有发现与编码EgM9蛋白的相似序列,有关EgM9蛋白的功能以及成熟虫体虫卵的基因表达目前研究也不是十分清楚。EG＿09888基因在细粒棘球绦虫成虫减数分裂受精卵的形成过程中高表达,所以本研究通过建立细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育体外模型,形态学鉴定体外不同时期虫体的发育状况并采集体外培养不同时期的虫体,可以为EgM9基因干预影响虫体发育提供不同阶段的材料。用实时荧光定量PCR法（Real time-quantitative PCR,RT-q PCR）确定不同发育时期虫体中EgM9及EG＿09888基因的表达情况,为探索EgM9基因在细粒棘球绦虫成虫发育中的功能提供试验依据,也为未来开发研制有效的抗细粒棘球绦虫犬用疫苗提供技术支撑。（1）本研究以三组不同品质营养血清（第1组:20%胎牛血清;第2组:前15 d 20%新生牛血清+后10 d 20%胎牛血清;第3组:20%新生牛血清）对体外培养25 d内不同发育时间（3 d、10 d、17 d、25 d）虫体成活率进行计数。以第2组血清培养液,设3组筛选刺激原头蚴外翻成分（第1组:纯水刺激+0.02%牛磺胆酸盐;第2组:0.02%牛磺胆酸盐;第3组:0.2%胰蛋白酶+0.02%牛磺胆酸盐）在体外培养32 d内不同发育时间（0 d、7 d、15 d、22 d、32 d）统计虫体的外翻率。试验结果表明:添加0.2%胰蛋白酶和0.02%牛磺胆酸盐前15 d 20%新生牛血清,以后20%胎牛血清的完全培养基原头蚴的外翻率和成活率最好,进而建立起细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育的体外培养模型。显微镜下观察虫体在第20 d有分节现象,产生第一个节片;此后第30 d、40 d幼节逐渐增长;直至第50 d产生成节。（2）本研究以细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育不同时期虫体作为材料,进行苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）观察形态学、提取RNA、反转录成c DNA,通过普通PCR对目的片段进行扩增,以β-Actin作为内参基因,用RT-qPCR定量检测不同时期虫体EgM9基因及EG＿09888基因的表达水平。试验结果表明:以体外培养第0 d虫体表达量作为基准,用2-ΔΔCt法计算结果,EgM9及EG＿09888基因在体外培养第50 d虫体的表达量最高且无显著差异（P＞0.05）,与其他不同培养天数虫体表达量存在显著差异（P＜0.05）。（3）本研究使用RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）,根据EgM9基因设计并合成了3对si RNA分子,探索细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向体外发育过程中不同阶段虫体电转效率及沉默效果。试验结果表明:无脓肿包囊的原头蚴电转效率更高,在体外培养第3 d、15 d、30 d的虫体其电转效率均可达90%～95%,虽电转条件及效率成立,虫体表型出现不同程度的变化,但RT-q PCR未发现EgM9基因有沉默效果。本研究建立细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育的体外培养模型,这易于研究在体外培养不同时期虫体的生长发育及基因的表达和干预,从而为细粒棘球绦虫免疫学、生物发育学、特异性发育的功能基因学以及疫苗研制提供基础,同时也为细粒棘球绦虫基因干预技术提供一定试验平台。
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