研究背景肝癌已成为全世界第五大最常见的恶性肿瘤和第三位肿瘤相关死亡的主要病因。大部分的肝癌患者诊断时属于晚期阶段,具有各种肝内外的转移。尽管多种先进的治疗手段用于肝癌的治疗,如手术切除,射频,微波消融,化疗及肝脏移植,由于早期的转移及频繁的术后复发,肝癌的预后非常差,5年的术后生存率仅为40%-50%。因此,肝癌的转移与复发已成为影响预后的关键因素,寻找新的转移机制并及时干预对提高患者的预后具有重要意义。越来越多的研究表明SIRT1在肿瘤进展中的作用存在双面性,SIRT1的高表达可促进前列腺癌,胰腺癌及黑色素瘤细胞的侵袭和转移,但上调SIRT1的表达可抑制口腔鳞状细胞癌的迁移和侵袭,然而SIRT1的表达与肝癌的转移及预后仍不清楚。该研究在明确SIRT1在肝癌中的表达模式及与临床预后的相关性的基础上,揭露SIRT1通过促进肝癌的侵袭和转移而影响肝癌的预后,通过发现SIRT1与PGC-1α的相互作用,阐明了SIRT1通过促进PGC-1α介导的线粒体发生而促进肝癌转移的新机制。研究方法(1)收集第三军医大学新桥医院肝胆外科不同分期的原发性肝癌患者术中的肝癌组织及相邻非肿瘤组织共72例,同时收集5例无肝病的正常肝组织,术中收集的组织部分立即冻存于-80℃中,用于提取蛋白及RNA,另一部分组织用4%多聚甲醛固定,经石蜡包埋,切片成5μm用于免疫组织化学染色。Western blot用于检测SIRT1在肝癌组织及肝癌细胞株中的蛋白表达水平,Real Time PCR实验检测SIRT1在肝癌样本中的m RNA表达水平,免疫组织化学检测SIRT1在肝癌组织中的表达部位及强度。(2)采用慢病毒转染和嘌呤霉素筛选的方式构建稳定转染的肝癌细胞株。CCK-8试剂盒用于检测细胞的活力,Cell-LightTM Ed U Apollo 567试剂盒检测细胞的增殖,通过皮下移植实验检测SIRT1对肝癌的成瘤性的影响。创伤愈合实验与Transwell迁移实验用于检测SIRT1对肝癌细胞迁移能力的影响,而检测肝癌细胞侵袭能力的改变通过Transwell侵袭实验完成,尾静脉注射实验检测敲除SIRT1后肝癌细胞体内转移能力的改变,活体动物成像技术动态监测敲除SIRT1后肝癌细胞全身转移形成的变化,而苏木精伊红染色实验检测肝癌细胞在肺组织中形成的肿瘤结节。(3)免疫荧光染色实验检测EMT标志物CK-18,vimentin,fibronectin在肝癌细胞中的表达。NAO染色和Mito Tracker?Red CM-H2XRos探针染色实验用于评价肝癌细胞中敲除SIRT1对线粒体质量的影响。采用E.Z.N.ATM DNA提取试剂盒提取细胞和裸鼠组织的总的DNA,然后通过Real Time PCR实验分析mt DNA copy number的变化,同时Real Time PCR实验用于检测mt DNA编码基因(COX I,ND1,ND6)的m RNA水平。采用ATP试剂盒分析肝癌细胞敲除SIRT1后及敲除SIRT1过表达PGC-1α后细胞内ATP水平的变化。免疫共沉淀实验检测SIRT1对PGC-1α的去乙酰化修饰而影响PGC-1α的活性。通过构建肝脏原位移植模型检测肝癌细胞中敲除SIRT1和过表达PGC-1α对裸鼠肝癌肺转移的影响。活体动物成像技术动态监测肝癌形成转移灶的部位和时间。(4)统计分析方法:定量比较SIRT1的蛋白表达及m RNA水平在肝癌组织及相邻非肿瘤组织中的差别采用配对t检验。SIRT1的相对表达水平与临床病理参数之间的比较,根据分组的不同采用非参秩和检验,Spearman相关分析。而患者无病生存期和综合生存率分别指从肝癌切除术当天开始到患者第一次复发或者死亡的时间,采用Kaplan-Meier’s分析评估SIRT1的相对表达量与患者无病生存期和综合生存率的关系,实验中两组间的数据采用Student’s t检验,而多组间的数据采用单因素方差分析。所有实验数据采用均数±标准误表示,而统计分析采用SPSS 13.0软件进行分析,双侧检验P值小于0.05定义为具有统计学差异。研究结果(1)SIRT1在肝癌细胞株中呈普遍的高表达相对于永生型肝细胞株L02,SIRT1在肝癌组织中的转录水平较相邻的非肿瘤组织明显增高(n=24,P=0.005),而SIRT1在肝癌组织中呈普遍高表达模式,过表达率为56.9%(41/72),而其蛋白表达水平在肝癌组织中较相邻非肿瘤组织明显增高(n=72,P=0.012)。免疫组化显示SIRT1在肝癌组织中的表达水平较相邻非肿瘤组织及正常肝组织均明显增高,且在肝癌组织中主要位于细胞核。临床参数相关分析发现增高的SIRT1表达水平与门静脉癌栓形成(P=0.0039),肝癌晚期的TNM分期(P=0.0016)密切相关,而与其他病理参数无明显相关性,如年龄,性别,HBV感染,Child–Pugh肝功能分级,肝硬化程度,血清AFP水平,肿瘤大小,Edmondson–Steiner病理分级,Milan标准。Kaplan-Meier’s分析发现SIRT1过表达的患者较SIRT1低表达的患者有更短的无病生存期(P=0.021)和更差的综合生存率(P=0.039),以上结果表明SIRT1的表达水平可作为预测肝癌复发和预后的有效指标。(2)肝癌细胞株中过表达或者敲除SIRT1不影响细胞的活力或者增殖,而体内实验显示在肝癌细胞MHCC97H中SIRT1敲除组与对照组显示出相似的肿瘤细胞增殖曲线,且肿瘤体积和重量在两组间无明显差异。以上结果表明SIRT1的表达对肝癌细胞的增殖和成瘤性无明显影响。肝癌细胞MHCC97中创伤愈合能力在SIRT1稳定敲除组较阴性对照组明显降低(P<0.01),Transwell实验证明了敲除SIRT1显著降低了MHCC97H细胞的迁移能力(P<0.01)和损伤了MHCC97H细胞的侵袭能力。另外,SIRT1过表达明显增加了肝细胞株L02细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。因此,以上结果表明SIRT1的表达可增强肝癌细胞体外的迁移和侵袭能力。裸鼠尾静脉注射实验中,荧光信号分析显示SIRT1敲除的MHCC97H细胞形成的全身转移较对照组明显减少(P<0.01),肝癌细胞MHCC97H在肝脏表面形成的转移性肿瘤结节在SIRT1敲除组较对照组明显降低(P<0.01),肝癌细胞MHCC97H的肺转移发生率在SIRT1敲除组较对照组明显降低。综上所述,SIRT1的表达可促进肝癌的侵袭和转移。(3)肝癌细胞MHCC97H,SK-Hep1敲除SIRT1和Huh7细胞中过表达SIRT1后,EMT上皮标志物(E-cadherin,CK-18),间质标志物(vimentin,α-SMA)和转录因子(snail,twist)的蛋白表达水平无明显变化。肝癌细胞MHCC97H敲除SIRT1对一系列EMT关键标志物(E-cadherin,fibronectin,vimentin,twist,and snail)的m RNA水平无明显影响。免疫荧光染色显示在肝癌细胞MHCC97H和SK-Hep1中沉默SIRT1的表达不能诱导EMT的进程。缺氧环境中肝癌细胞Hep G2过表达SIRT1也不能影响EMT标志物的表达。TGF-β1诱导的肝癌EMT模型中,SIRT1的表达水平无明显变化。以上结果表明SIRT1的表达对肝癌EMT的进程无明显的影响。肝癌细胞MHCC97H在稳定敲除SIRT1后,线粒体的质量、线粒体DNA拷贝数、线粒体DNA转录本(COX I,ND1,ND6)、细胞内ATP水平和线粒体发生相关基因(Tfam,COX IV,TOMM20)的蛋白水平均明显降低,以上结果表明肝癌细胞中敲除SIRT1降低了线粒体发生的能力及损伤了线粒体的功能,导致了生物能量产生的缺陷。临床标本研究中SIRT1的过表达与PGC-1α的上调在肝癌组织相对于相邻的非肿瘤组织存在明显的正相关关系(r=0.569,P<0.001);在肝癌细胞MHCC97H和Huh7中过表达SIRT1可明显增加PGC-1α的表达水平,而MHCC97H细胞中敲除SIRT1可明显升高PGC-1α的乙酰化水平从而降低了PGC-1α的活性。而在肝癌细胞Huh7,MHCC97H中过表达PGC-1α明显增加了细胞的迁移、侵袭能力,提高了细胞的线粒体DNA拷贝数及线粒体DNA编码基因(COX I,ND1,ND6)的m RNA水平,该结果表明PGC-1α促进肝癌细胞的迁移和侵袭通过增强线粒体的发生而介导的。过表达PGC-1α明显恢复了肝癌细胞MHCC97H因敲除SIRT1所致的降低的迁移和侵袭能力,同时,线粒体DNA拷贝数,线粒体DNA转录本(COX I,ND1,ND6),细胞内ATP水平和线粒体发生相关基因(Tfam,COX IV,TOMM20)的蛋白水平在过表达PGC-1α而敲除SIRT1的MHCC97H组中较单独敲除SIRT1的MHCC97H细胞组明显增高,该结果表明过表达PGC-1α可逆转SIRT1敲除对肝癌细胞侵袭和线粒体发生降低的抑制效应。在裸鼠原位抑制模型中,肝癌细胞SIRT1敲除组的荧光信号强度和肺组织肿瘤结节数量较对照组明显降低,而过表达PGC-1α后可逆转该抑制效应,而来源于裸鼠转移性肺组织的线粒体DNA拷贝数,线粒体DNA转录本(COX I,ND1,ND6)及线粒体发生相关基因的蛋白表达水平在敲除SIRT1的MHCC97H组中较对照组明显降低,而过表达PGC-1α后可恢复其表达水平,该结果表明PGC-1α介导的线粒体发生增强在SIRT1促进肝癌转移过程中发挥关键作用。研究结论综上所述,SIRT1普遍高表达于肝癌组织,且其相对表达水平与肝癌微血管侵犯,肿瘤TNM分期,肝癌的复发和综合生存率具有明显的相关性,表明SIRT1的表达水平可作为评估肝癌转移的有效的预后指标。敲除SIRT1明显降低肝癌细胞的体外侵袭和体内的转移。进一步机制研究发现敲除SIRT1可明显降低线粒体发生的水平和减少ATP的产生,但却不影响上皮间质转化(EMT)的进程。肝癌组织中SIRT1的过表达与PGC-1α的上调明显相关,而肝癌细胞中外源性过表达SIRT1明显增加PGC-1α的表达水平,敲除SIRT1的表达可降低PGC-1α的活性。通过细胞株及肝脏原位移植模型实验证实PGC-1α的过表达可以逆转敲除SIRT1所致的肝癌细胞侵袭和转移能力的降低,是通过增强线粒体的发生而介导。通过该研究,阐明了SIRT1促进肝癌转移的新机制,为探索高效的用于SIRT1/PGC-1α轴的靶向治疗提供理论依据,为丰富肝癌的个体化治疗和提高预后具有积极的意义。