研究背景组织移植是整形外科临床上最常用的治疗手段，临床实践中往往较厚的组织，以及体积较大的组织，因为不能在耐缺血时间内，及时、有效的重建血液循环而不易成活，这仍是整形外科目前在临床广泛应用中面临的巨大难题。因此移植术后能否及时、有效的重建血运是提高移植组织成活率和成活质量的关键。而实现这一目的的重要途径就是及时、高效的促进缺血局部血管新生。血管新生目前认为血管新生主要通过血管形成（angiogenesis）、血管生成（vasculogenesis）以及动脉形成（arteriogenesis）三种机制作用的结果。在缺血病变中，如何能有效的促进血管新生？既往的无论是从各种生长因子，还是从血管前体细胞及干细胞在血管新生中的研究，都只是局限于超过机体生理量的增加这些对于血管新生有关的因子水平，研究中出现各种副作用，比如水肿、肿瘤等，虽取得一些成就，但所存在的各种问题，仍是其在临床广泛应用的瓶颈。这也使一些学者改变思路，是否可以从血管新生相关的信号通路入手？近年来随着研究的不断深入与拓宽，microRNA（miRNA）逐渐引起人们的注意。miRNA具有组织特异性及细胞特异性，其中内皮细胞特异性高表达miRNA-126(miR-126)在血管新生中具有举足轻重的作用，通过下调抑制血管生成信号通路的胞内抑制蛋白（spred-1和PIK3R2/p85β）的表达，从而促进血管新生，这给调节血管新生提供了一种新的思路，从基因水平对其进行调控有可能是解决这个问题的新突破。对于miR-126在血管新生方面的研究，目前仍处于初期探索阶段，尤其是对于在活体缺血组织中miR-126水平的表达情况，是否可以通过人为地改变miR-126水平，来促进活体缺血组织的血管新生，以及促进缺血组织血管新生作用可能的信号通路？目前还尚无报道。实验目的本课题旨在通过体外扩增、合成、克隆mus-mir-126,重组腺病毒包装、纯化以及滴度测定。局部注射于小鼠的缺血后肢模型，观察其局部表达情况的变化，以及促血管新生的作用。通过检测miR-126作用通路中各种因子的表达水平，来探究、证实miR-126具有明显的促缺血组织血管新生作用，并初探其作用机制。使miR-126基因治疗在临床上应用成为可能。实验方法根据mus-mir-126的基因信息,设计上下游引物，用小鼠基因组DNA为模板扩增mus-mir-126基因；全基因合成mus-mir-126基因至PES载体上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5CMV-IRES-GFP载体上；质粒扩增及线性化；重组腺病毒的包装；重组腺病毒的大量扩增和滴度测定。C57小鼠随机分为A组（C57左侧缺血后肢手术组）、B组（空病毒C57左侧缺血后肢手术组）、C组（重组腺病毒miR-126C57左侧缺血后肢手术组）、假手术组（正常小鼠组）四组。借助显微外科器械建立C57小鼠左后肢缺血模型，术后即刻将滴度为1×109（PFU/mL）重组腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓肠肌。术后对小鼠大体状况紧密观察，并在3、7、14天各组（6只）分别对小鼠腓肠肌取样，做HE染色，免疫组化CD31、a-SMA染色，实时定量PCR检测miR-126水平以及Western-blot对ERK1/2、pERK1/2、AKT和pAKT蛋白水平的检测。整理、统计数据。实验结果通过体外构建Ad-mir-126测序结果正确(见附录),质粒鉴定结果(见正文)正确,病毒的PFU滴度达2.00×109（PFU/mL）。通过局部注射于小鼠的缺血腓肠肌中后，观察到HE染色、CD31、α-SMA免疫组化染色检测结果一致，均显示C组较A、B两组血管内皮细胞增生明显，新生血管数目计数明显增多。实时定量PCR检测显示A组第3天miR-126表达水平明显降低，此后呈逐渐增高的趋势，直至第14天还未及正常水平。而C组第3天miR-126表达水平高于正常水平，至第7天达最高水平，然后逐渐降低，至第14天时仍高于正常水平。Western-blot检测结果显示C组较A、B组VEGF、bFGF等介导的IP3和MAPK信号通路中pERK1和pAKT活化水平增高。结论体外构建重组腺病毒mir-126，测序结果正确，质粒鉴定结果完全正确，滴度可达2.00×10~9（PFU/mL），说明此技术既安全又高效，是完全可行的。C57小鼠缺血后肢中内源性miR-126的表达水平明显降低，通过Ad‐mir-126局部注射于C57小鼠缺血后肢，可以明显的提高缺血局部miR-126的表达水平，观察到促进缺血局部血管新生的作用，并且初步探讨了miR-126是通过激活Akt、ERK1/2的相关通路，来促进小鼠缺血后肢血管新生的作用机制。