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目的:观察S1P受体各亚型与S1P抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用的相关性,并初步探讨S1P是如何调节大鼠缺氧/复氧损伤后线粒体功能进而发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用的。方法:一、S1P及其受体阻断剂对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响1.大鼠H9c2心肌细胞的缺氧/复氧模型的建立:培养H9c2细胞需用含有10%FBS的低糖DMEM培养基,正常培养24 h后,将培养液倾掉,换用缺氧液,在缺氧装置中缺氧培养16 h,之后换成无FBS的DMEM培养基,复氧条件下培养4 h。2.分组:将H9c2大鼠心肌细胞随机分为正常对照组(C组);缺氧/复氧组(H/R组);S1P组;相应受体阻断剂+S1P组以及受体阻断剂对照组。(1)C组:在正常培养后,换成无FBS的低糖DMEM培养基;(2)H/R组:在缺氧装置中用缺氧液培养16 h,然后换成DMEM培养基复氧培养4 h;(3)S1P组:在复氧时加入终浓度为4μM的S1P的DMEM培基培养4 h;(4)W146+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为10μM的W146(S1P1受体阻断剂)预处理,复氧时再换成含W146和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(5)W146组:在复氧前30 min加入10μM的W146,然后复氧培养4 h;(6)CAY10444+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为10μM的CAY10444(S1P3受体阻断剂)预处理,复氧时再换成含CAY10444和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(7)CAY10444组:在复氧前30 min加入10μM CAY10444,然后复氧培养4 h;(8)JTE013+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为10μM的JTE013(S1P2受体阻断剂)预处理,复氧时再换成含JTE013和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(9)JTE013组:在复氧前30 min时加入10μM的JTE013,然后复氧培养4 h;(10)VPC23019+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为5μM的VPC23019(S1P1、3受体阻断剂)预处理,复氧时再换成含VPC23019和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(11)VPC23019组:在复氧前30 min加入5μM的VPC23019,然后复氧培养4 h;(12)PTX+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为1μg/m L的PTX(Gi蛋白偶联受体阻断剂)预处理,复氧时再换成含PTX和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(13)PTX组:在复氧前30 min时加入1μg/m L的PTX,然后复氧培养4 h。3.测定指标:(1)通过MTT法测量细胞活力。(2)通过流式细胞术检测细胞凋亡率。(3)检测细胞培养基中乳酸脱氢酶含量。二、S1P抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的线粒体机制研究。1.分组:将H9c2大鼠心肌细胞随机分为正常对照组(C组);缺氧/复氧组(H/R组);S1P组;STATTIC+S1P组以及STATTIC组。(1)C组:在正常培养后,换成无FBS的低糖DMEM培养基;(2)H/R组:在缺氧装置中用缺氧液培养16 h,然后换成DMEM培养基复氧培养4 h;(3)S1P组:在复氧时加入终浓度为4μM的S1P的DMEM培基培养4 h;(4)STATTIC+S1P组:在复氧前30 min时先加入终浓度为1μM的stattic(STAT3抑制剂)预处理,复氧时再换成含stattic和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;(5)STATTIC组:在复氧前30 min时加入1μM stattic,然后复氧培养4 h。2.测定指标:(1)通过MTT法测量细胞活力。(2)通过流式细胞术测量细胞凋亡率。(3)检测细胞培养基中乳酸脱氢酶的含量。(4)使用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位、线粒体钙离子浓度、线粒体通透性转换孔开放和线粒体内ROS。(5)利用免疫荧光测定法检测线粒体细胞色素C的释放。(6)利用Western blot法测定Bcl-2和Bax,caspase3前体和活性的caspase3蛋白表达水平。结果:一、S1P及其受体阻断剂对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。与C组相比,H/R组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率和LDH含量显著增加;与缺氧/复氧组相比,S1P组显著增加缺氧/复氧后H9c2细胞存活率(P<0.01),显著降低细胞凋亡率(P<0.01)和LDH含量(P<0.01)。与S1P组相比,PTX+S1P、W146+S1P、CAY10444+S1P、VPC23019+S1P组可显著降低H9c2细胞存活率(P<0.01),增加细胞凋亡率(P<0.01)和细胞培养液LDH含量(P<0.01),显著阻断S1P抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用(P<0.01)。S1P2受体拮抗剂,JTE013对S1P作用无影响。二、S1P抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的线粒体机制研究。与C组相比,H/R组细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率和LDH含量显著增加(P<0.01);线粒体膜电位显著下降(P<0.01),钙离子水平和活性氧簇显著增加(P<0.01),通透性转换孔开放程度显著增加(P<0.01),细胞色素C释放显著增加(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白相对表达水平明显增加(P<0.01),Cleaved caspase3/Pro-caspase3蛋白相对表达水平明显增加;与缺氧/复氧组(H/R组)相比,S1P组显著增加缺氧/复氧后H9c2细胞存活率(P<0.01),显著降低细胞凋亡率(P<0.01)和LDH含量(P<0.01),S1P组显著升高线粒体膜电位(P<0.01),显著降低线粒体内钙离子水平P<0.01),显著降低线粒体内ROS水平(P<0.01),线粒体通透性转换孔开放程度明显降低(P<0.01),线粒体细胞色素C释放明显减少,Bax/Bcl-2蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01),Cleaved caspase3/Pro-caspase3蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01);与S1P组相比,Stattic+S1P组细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率和LDH含量显著增加(P<0.01);线粒体膜电位显著下降(P<0.01),钙离子水平和活性氧簇显著增加(P<0.01),通透性转换孔开放程度显著增加(P<0.01),细胞色素C释放显著增加,Bax/Bcl-2蛋白相对表达水平明显增加(P<0.01),Cleaved caspase3/Pro-caspase3蛋白相对表达水平明显增加(P<0.01)。结论:1.S1P抗心肌缺氧复/氧损伤作用与其激动细胞膜S1P1、3受体有关。2.S1P可通过降低线粒体细胞内钙离子浓度和ROS水平、降低线粒体膜电位,抑制线粒体通透性转换开放,抑制线粒体细胞色素C释放,进而抑制胞浆caspase3信号通路的激活,抑制线粒体通路引起细胞凋亡,并且能够逆转线粒体的损伤和改善线粒体的功能,从而发挥抗心肌细胞缺氧和复氧损伤的作用,该作用与STAT3通路激活有关。