第一部分白藜芦醇的心肌保护作用及其机制的研究　　缺血性心肌损伤是当今人类疾病导致死亡的主要原因之一。冠状动脉血流中断和再灌注致心肌坏死和心肌收缩功能丧失，称为心肌缺血/再灌注损伤。再灌注对心肌产生一系列影响，包括心肌超微结构的变化以及心肌能量代谢的变化。目前，缺血/再灌注损伤发生的机制尚未完全阐明。研究表明，自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞、血管内皮细胞、细胞粘附因子与细胞凋亡等均参与缺血/再灌注损伤。其中，自由基和钙超载互为因果，在缺血/再灌注损伤中具有重要意义。近年来对心肌缺血再灌注损伤的研究取得了很大进展，很多动物实验证明许多药物能够减轻心肌缺血再灌注损伤。其中白藜芦醇（Resveratrol，化学名为3,4,5-三羟基二苯乙烯）的心肌保护作用受到广泛关注。这是因为白藜芦醇长久以来被认为是“法国悖论”的关键因素，即有喝红酒习惯的法国人虽然吃了很多高热量的饮食，但心血管疾病发病率却很低。白藜芦醇是一种在红酒和葡萄中存在的多酚类化学物质，具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症等生物学特性。目前研究认为，白藜芦醇通过诱导药物性预处理机制减轻缺血/再灌注损伤，但其详细的细胞信号转导和分子机制尚不清楚。最近研究表明，线粒体膜通透性转移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在心肌缺血/再灌注损伤中起关键性作用。缺血时，mPTP保持关闭状态，而再灌注时mPTP开放。而且研究发现，mPTP开放发生在再灌注早期而不是在缺血期。因此，在早期再灌注时如能有效地抑制mPTP的开放，是保护再灌注心肌的关键。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的作用最初认为是调节糖原合成，并参与细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖与分化、凋亡等过程。最近研究证实，GSK-3β在心肌保护中也起非常重要的作用，其机制主要是通过其Ser9位点的磷酸化，使其活性被抑制，进一步阻止mPTP的开放而保护再灌注损伤的心肌。鉴于以上研究，白藜芦醇在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用可能是通过GSK-3β的失活并抑制mPTP的开放而引起。因此，本研究对GSK-3β和mPTP在白藜芦醇诱导的心肌保护中的作用进行了初步探讨。　　本实验首先制备大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型（Langendorff装置），用TTC染色法测定心肌梗塞面积。结果显示，离体大鼠心脏再灌注时给予白藜芦醇（10μmol/L），可以明显减少心肌梗塞面积，明显增加再灌注时冠状动脉流量（coronary flow，CF）和左心室发展压（left ventricular-developed pressure，LVDP）。白藜芦醇的这种抗梗塞作用可被mPTP开放激动剂苍术苷（atractyloside）所逆转，提示白藜芦醇通过抑制mPTP的开放而保护再灌注心脏。另外，线粒体肿胀试验显示，白藜芦醇能够抑制Ca2+诱导的线粒体肿胀，再次证明白藜芦醇能够抑制心肌细胞mPTP的开放。　　其次，用Western blotting的方法检测离体大鼠心脏GSK-3β的磷酸化（Ser9位点）。结果显示，白藜芦醇明显增加再灌注时 GSK-3β的磷酸化（Ser9位点），说明白藜芦醇能够使GSK-3β失活。白藜芦醇抑制GSK-3β活性的作用被鸟苷酸环化酶抑制剂 ODQ所阻断，并且白藜芦醇使再灌注心脏血管扩张刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoporotein，VASP）的磷酸化增加，说明白藜芦醇诱导的GSK-3β磷酸化作用与鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（GC-cGMP-PKG）信号转导通路有关。由于GSK-3β失活可以抑制mPTP的开放，从而保护再灌注心肌，因此本实验进一步检测了线粒体GSK-3β的水平。结果显示，再灌注时给予白藜芦醇明显增加线粒体GSK-3β水平。由于在生理条件下GSK-3β主要存在于细胞浆，因此白藜芦醇使GSK-3β从细胞浆转移到线粒体，从而使GSK-3β有机会与mPTP结合。在分离的大鼠心肌细胞中，白藜芦醇使线粒体GSK-3β增加的作用同样被鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ所阻断，进一步证实cGMP-PKG信号转导通路介导白藜芦醇诱导的GSK-3β由胞浆向线粒体的转移。　　另外，利用免疫共沉淀方法探讨转移到线粒体的GSK-3β与mPTP成分相互作用时发现，GSK-3β与mPTP的组成成分亲和素D（Cyclophilin D，CypD）相结合，而不和外膜上的电压依赖性阴离子通道（the Voltage-Dependent Anion Channel，VDAC）或内膜上的腺嘌呤核苷酸转位酶（the Adenine-Nucleotide Translocase，ANT）相互作用，表明白藜芦醇通过诱导GSK-3β与线粒体膜成分亲和素D结合而抑制mPTP开放，从而保护心脏。　　小结　　1.白藜芦醇通过使GSK-3β失活而抑制mPTP开放，保护再灌注心肌。　　2.白藜芦醇通过cGMP-PKG信号转导通路使GSK-3β失活并诱导其从细胞浆转移至线粒体。　　3.转移至线粒体的GSK-3β最终与线粒体膜成分亲和素D结合而抑制mPTP开放，从而保护心脏。　　第二部分锌的心肌保护作用及其机制的研究　　锌存在于所有细胞中，除了构成细胞结构蛋白、酶、及转录因子外，其本身参与多种生理功能。它通过调节细胞信号识别、第二信使代谢、蛋白激酶的磷酸化等在细胞信号转导中起重要作用。最近研究报道，锌能够激活PI3K/Akt信号途径，抑制GSK-3β活性，而PI3K/Akt及GSK-3β在心肌缺血/再灌注损伤的保护中起重要作用。GSK-3β失活而阻止 mPTP开放，是许多药物性预处理保护心脏的共同机制。因此，本实验利用H9C2大鼠心肌细胞株，探讨外源性锌能否通过抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的开放，从而保护缺血再灌注心肌细胞。　　本实验首先用ZnCl2（10μmol/L）及锌载体Pyrithion处理H9C2细胞20分钟，然后利用 Western blotting的方法分析 GSK-3β磷酸化情况。结果显示，锌能使GSK-3β（Ser9）磷酸化明显增加，提示外源性锌可抑制H9C2细胞中GSK-3β的活性。　　其次，为了分析锌抑制GSK-3β的信号介导机制，本实验用PI3K、mTOR以及PKC抑制剂LY-294002、Rapamycin及Chelerythrine处理了细胞。结果显示，锌诱导的GSK-3β磷酸化增加的作用被LY-294002而不是Rapamycin及Chelerythrine所抑制，锌能够明显增加 Akt而不是 mTOR的磷酸化水平，提示 PI3K/Akt而不是mTOR或PKC参与锌的作用。　　进一步的研究显示，锌能够明显增加线粒体GSK-3β磷酸化水平，表明线粒体参与锌的作用。锌诱导的线粒体GSK-3β磷酸化增强的作用没有被线粒体ATP敏感性钾离子通道（mKATP）抑制剂5-HD所阻断，表明 mKATP不参与锌诱导的线粒体GSK-3β磷酸化过程。在H9C2细胞缺血/再灌注模型中，锌能够明显减轻再灌注时细胞死亡，表明锌能防止再灌注损伤。为了进一步探讨GSK-3β是否在其中发挥作用，利用持续激活型GSK-3β质粒DNA（GSK-3β-S9A-HA，不受GSK-3β上游激酶下调而持续激活）转染了细胞。结果显示，在转染了这种质粒的细胞中，锌不能减轻再灌注损伤。用持续抑制型 GSK-3β（GSK-3β-KM-HA）转染细胞后，细胞死亡率也明显降低，提示GSK-3β失活在锌引起的心肌保护中起重要作用。　　另外，共聚焦显微镜观察显示，锌明显抑制H2O2诱导的TMRE荧光减少，而在 GSK-3β-S9A-HA转染细胞中锌的这种作用消失，表明锌通过抑制 GSK-3β活性而阻止mPTP的开放。　　小结：　　（1）外源性锌可抑制H9C2心肌细胞中GSK-3β的活性，PI3K/Akt信号途径可能介导锌的这种作用。　　（2）锌通过使GSK-3β失活而阻止mPTP开放，从而减轻再灌注损伤。