灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌,是我国传统的补益药。现代药理学研究表明,灵芝多糖作为灵芝中主要的活性成分之一,具有调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化和强心等作用。但灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP)属于大分子多糖,在应用时存在体内代谢较快,作用时间短、靶向性弱、易聚集等不足。因此,为了提高灵芝多糖靶向性或延长其作用时间,对其新剂型的开发显得尤为重要。脂质体是一种微小囊泡,它具有类似生物膜结构的磷脂双分子层。脂质体不仅能够有效递送药物,而且能作为疫苗递送系统。脂质立方液晶纳米粒具有两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状”结构,能够包封各种不同极性和剂量的药物,具有多样化的药物包裹性,具有很多应用功能,如保护药物活性、控制药物释放、靶向给药以及阻止药物分子间发生聚集等。脂质立方液晶纳米粒因其独特的内部结构能够有效地运载药物或抗原。将灵芝多糖包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,不仅可以利用脂质体和脂质立方液晶纳米粒的良好药物载体优势帮助灵芝多糖有效递送,还可以利用二者优点,弥补二者不足,从而更有效地发挥免疫增强作用。因此,本研究将灵芝多糖分别包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,制备成灵芝多糖脂质体(Ganoderma lucidum polysaccharide liposome,GLPL)和灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒(Ganoderma lucidum polysaccharide Cubosome,GLPC),对其质量和稳定性进行了评价,并从体外试验和体内试验研究了其免疫增强作用和作用机理。试验分为以下八个部分:试验Ⅰ 灵芝多糖脂质体的制备及制备条件的优化为了得到包封率高的灵芝多糖脂质体,本试验采用逆相蒸发法制备灵芝多糖脂质体并用响应曲面法优选GLPL制备的最佳条件。首先,以GLPL的包封率和载药量为指标,考察了 4个单因素对GLPL制备的影响,筛选出磷脂与胆固醇质量比、磷脂与吐温80的质量比、超声时间等对GLPL制备影响较大的3个单因素。然后,采用响应面分析法以包封率为响应值研究单因素试验筛选出的3个因素对GLPL制备的影响,经过优化后得到GLPL最佳制备条件为:磷脂与胆固醇质量比11:1,磷脂与吐温80质量比为10.5:1和超声时间为1 1min。在最佳制备条件下进行验证试验,得到的GLPL的包封率实测平均值为71.43±0.49%,与包封率预测值相比,相对误差仅为1.6%。所制备的GLPL,经过透射电镜观察发现形状呈类球形,大小均一;经过马尔文粒度分析仪测得粒径为164.3±9.2 nm。试验Ⅱ灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖及分化的影响。本试验将不同浓度的灵芝多糖脂质体单独或者与LPS或PHA同时加入小鼠脾脏淋巴细胞中,采用MTT法和流式细胞仪分别测定了 GLPL对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和脾脏淋巴细胞分化的影响。结果显示,在单独或者协同LPS、PHA作用下,GLPL均能明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。在浓度为62.5μg/mL时,GLPL单独或者协同LPS、PHA刺激淋巴细胞增殖的作用最强,且显著好于GLP、BL及空白对照组;与GLP相比,GLPL能够更加有效地促进T淋巴细胞向CD4方向分化。试验表明GLP经过脂质体包封后对脾脏淋巴细胞增殖的作用和对脾脏淋巴细胞的分化得到明显增强。试验Ⅲ 灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、分泌细胞因子等功能的影响,本试验将不同浓度的GLPL、GLP和空白脂质体加入到小鼠腹腔巨噬细胞中,利用流式细胞仪检测药物对腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记的大肠杆菌的能力和MHCⅡ分子表达的影响,采用ELISA法测定药物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子以及炎症因子NO、iNOS的影响。结果显示,GLPL能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和表面MHCⅡ分子的表达,能显著促进巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子,并通过促进iNOS的活性进一步促进NO的产生,且在一定浓度下,效果好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后活化巨噬细胞的能力更强。试验Ⅳ 灵芝多糖脂质体对OVA免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体包封OVA后的质量评价和免疫增强作用,本试验首先采用冷冻复融法将OVA包封于GLPL中,分别测定在4℃和37℃保存时在不同时间点的脂质体中OVA的包封率和4℃保存时不同时间点的脂质体的粒径和分散系数。然后,将120只5周龄的BALB/c小鼠随机均分成6个组,分别皮下免疫含不同免疫增强剂的OVA,每周免疫一次,重复免疫三次。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,各组随机抽取4只,无菌取脾脏,分离脾淋巴细胞,分别采用MTT法和流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞增殖和分化;收集不同时间段的小鼠血清,采用ELISA法测定OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。结果显示,GLPL包封抗原后在4℃保存时,包封率下降速度低于37℃保存时;其粒径和分散系数在28天内变化较小,稳定性较好;佐剂活性试验结果显示,GLPL能显著促进小鼠淋巴结中DCs的成熟,促进脾脏淋巴细胞的增殖和分化,提高小鼠体内OVA特异性抗体、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平以及IgG2a/IgG1的比值,且效果均好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后不仅促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟和活化脾脏淋巴细胞的能力增强,而且提高小鼠体液免疫和细胞免疫应答的作用也增强。试验Ⅴ 灵芝多糖脂质体对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体作为PCV-2苗佐剂的免疫增强作用,本试验将100只小鼠分成5组,分别免疫不同免疫增强剂的PCV-2疫苗,一周后二免。在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;并在一免后的21天,采集小鼠脾脏,制作组织切片,采用HE染色观察各组脾脏组织学变化。结果显示,与GLP组和BL组相比,GLPL更能有效地促进小鼠产生PCV-2特异性IgG、抗体亚型IgG1.、IgG2a、IgG3及细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α;脾脏组织学结果显示,GLPL能够显著刺激小鼠脾脏脾小体的增大。试验表明GLPL作为PCV-2苗的免疫增强剂能够显著提高小鼠对PCV-2的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且效果好于GLP。试验Ⅵ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法优选及质量评价为了制备稳定性良好和包封率高的灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒,本试验对GLPC的制备方法进行了筛选,比较了不同分散介质对GLPC质量的影响,并对其基本特征进行了分析检测。结果发现,乙醇分散法制备的GLPC包封率较高;以双蒸水为分散介质制备的GLPC更加稳定;所制备的GLPC平均包封率为89.5±3.51%,粒径分析发现脂质立方液晶纳米粒包封GLP后,GLPC的粒径发生了轻微的增大,小角X散射实验SAXS(small-angle x-ray scattering,SAXS)结果显示GLPC晶型为Pn3m。试验表明采用乙醇分散法制备灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒质量较好。试验Ⅶ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了探讨灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2疫苗免疫增强剂的免疫增强作用,本试验分别将灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒、灵芝多糖和空白脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2的免疫增强剂,免疫小鼠,在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;在一免后24h和48h,采集淋巴结,采用流式细胞仪测定了淋巴结中DCs的成熟状态;在一免后7天,分别采用免疫组化法和流式细胞仪检测了淋巴结中抗原的含量和中央记忆T细胞和效应记忆T细胞的比例。结果显示,GLPC不仅能显著提高血清中PCV-2特异性IgG的水平和抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的浓度,而且能够显著地促进血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17和TNF-α的分泌;同时,结果显示GLPC能够促进淋巴结中DCs的成熟,提高抗原从皮下到淋巴结的转运效率和中央记忆细胞与效应记忆细胞的比例,与GLP相比效果更好。试验表明GLPC能够显著地促进淋巴结中DCs的成熟和记忆T细胞的产生,从而提高机体对PCV-2产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。试验Ⅷ修饰后灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫OVA的免疫增强作用为了将OVA吸附到灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的表面并研究其佐剂作用机理,本试验首先将两种阳离子修饰物十六烷基三甲基溴化按(cetyltrimeth-ylammonium bromide,CTAB)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly(diallyldimethylammo-nium chloride,PDDAC)分别修饰到GLPC的表面,制备成阳离子脂质立方液晶纳米粒。然后,将阳离子脂质立方液晶纳米粒作为OVA免疫增强剂,免疫小鼠,以GLPC为对照。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测淋巴结中树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,分别采用MTT法和流式细胞仪检测并计算脾脏淋巴细胞增殖指数和淋巴细胞分化;在三免后14和28天,收集小鼠血清,采用ELISA法测定特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。在三免后28天,采用转录组测序技术检测小鼠脾脏基因表达变化。结果显示,经过PDDAC 修饰的脂质立方液晶(PDDAC modified GLPC,PDDAC-GLPC)作为 OVA免疫增强剂同GLPC相比,不仅能有效地促进机体产生OVA特异性IgG,提高细胞因子的分泌和刺激脾脏CD4+和CD8+T细胞增殖,而且能明显地促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟,效果好于GLPC。CTAB修饰的脂质立方液晶(CTAB modified GLPC,CTAB-GLPC)作为OVA免疫增强剂,除了在提高特异性IgG的效果与GLPC相比差异不显著外,其他方面效果均好于GLPC组。进一步经过对脾脏基因测序发现PDDAC-GLPC的免疫增强作用主要通过NOD样受体通路、PI3K-ATK信号通路、细胞因子互作和白细胞跨内皮迁移作用激活脾脏的免疫反应。试验表明PDDAC-GLPC能显著地促进淋巴结DCs的成熟和脾脏中4条信号通路的活化,从而促进机体产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。