【摘 要】
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病毒基因型是丙型肝炎抗病毒治疗方案选择的重要依据,常见的分型方法有测序分析、反向线性杂交、实时荧光PCR等,不同的方法设计各有优势和不足,本文建立了一个荧光PCR结合熔
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病毒基因型是丙型肝炎抗病毒治疗方案选择的重要依据,常见的分型方法有测序分析、反向线性杂交、实时荧光PCR等,不同的方法设计各有优势和不足,本文建立了一个荧光PCR结合熔解曲线分析的丙型肝炎病毒(Hepatitis CvirUS,HCV)分型体系,用以区分中国大陆较常见的HCV1a、1b、2a、3a、3b、6a亚型。
实验方法如下:
一、制备6个内含HCV RNA核心区核酸序列的病毒样颗粒(HCV假病毒),分别作为6个HCV亚型的替代物/阳性质控品;
二、设计通用引物扩增出HCV基因组的核心区,并设计荧光探针与各HCV亚型扩增子杂交,使之得到亚型特异的熔点;
三、考察和优化体系的分型能力;
四、建立从RNA提取到PCR产物分析的检测流程,进行标本检测。
实验结果:
一、制各的6个HCV假病毒分别包裹了6个HCV亚型基因组核心区序列,且耐受核酸酶降解;
二、通用引物可成功扩增出6个HCV亚型基因组核心区序列,设计的两条荧光探针与各亚型序列杂交,可得到亚型特异的熔点,从而能够准确区分6个HCV亚型(在探针检测区有突变的病毒株除外);
三、分型体系的检测灵敏度1a、1b、2a、3b和6a达到50拷贝RNA,3a达到500拷贝RNA,对于1b和2a亚型双重感染,当两者RNA比例在1:95到95:1之间时可以检出;
四、用本方法检测由假病毒掺入阴性血清制成的模拟样本,1a、1b、2a、3b和6a检测限为50拷贝,3a检测限为500拷贝,可检出的样本均获得准确分型。两份HCV阳性血清样本(取自泉州180医院),其中一份准确分型为1b亚型,另一份未扩增到HCV核酸序列,可能是标本在储存和运输过程中病毒降解了。
实验结果表明,本文建立的方法基本达到设计目标,可简单快速地区分6个HCV亚型。
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