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视网膜病变、角膜损伤等眼科疾病严重影响病人的视力,临床上的现有疗法在治愈这些疾病方面还存在诸多困难。干细胞疗法为恢复病人正常视光学功能提供希望,是目前重点研究方向之一。干细胞分为胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和成体干细胞（Adult stem cells,ASCs）。其中ESCs是指来源于囊胚内细胞群的细胞群体,该群细胞具有自我更新能力和多向分化潜能的特点,存在非常重要的研究价值与应用前景,是再生医学的宝贵资源。ESCs的自我更新能力指在特定培养条件下,ESCs可以在体外无限增殖并维持多向分化潜能的能力。ESCs的自我更新维持是一个极其复杂的过程,细胞内外信号分子均参与了自我更新的调控。根据现有研究,外源性信号途径主要包含LIF/Stat3途径、BMP4/Smad途径和Wnt/β-catenin途径;内源性转录因子主要涉及Oct4/Sox2/Nanog多能性调控网络。除此以外,表观遗传调控机制,如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑,选择性剪接,细胞周期相关蛋白等也在自我更新调控中发挥重要作用。但目前为止,ESCs自我更新维持的具体机制仍不清楚并待进一步探究。探索调控ESCs自我更新的基因是生命科学研究的热点问题,是再生医学的重要研究内容,为干细胞的临床应用提供基础依据。通过基因编辑技术改变基因表达观察相应细胞表型是研究基因功能的一种重要手段。近几年,CRISPR/Cas9基因编辑系统作为新型的基因编辑技术,是生命科学的热点话题之一。CRISPR/Cas9系统基本原理是利用sg RNA的识别作用引导Cas9核酸内切酶于靶基因特定位点引入双链断裂。基于此原理,CRISPR/Cas9系统可以在DNA水平进行基因编辑,实现精准定向、简洁高效地对基因组进行敲除或修饰。该系统成为目前基因敲除的首选方法之一,已被广泛应用于药物筛选、疾病治疗靶点筛选、维持细胞功能关键基因筛选等重要生命科学领域。本文中,我们利用CRISPR/Cas9基因敲除文库在全基因组水平上筛选调控ESC自我更新的关键基因,将测序结果进行生物信息学分析,挑选靶基因进行功能验证,并初步分析靶基因与肿瘤发生的联系,为更好的理解ESC自我更新调控机制提供理论依据。主要结论总结如下:1.基于全基因组文库筛选自我更新关键基因结果及生物信息学分析本研究利用靶向19674个基因的sg RNA的敲除文库感染R1-m ESC-Cas9稳定细胞系,通过筛选得到1375个sg RNA比例上升基因（定义为UP基因）,该基因群包含已知与凋亡和分化相关基因。通过对上调基因群体进行GO注释,我们发现该群基因主要成分集中于膜结构。在生物学功能方面,上调基因主要涉及信号转导、细胞分化、细胞凋亡;通过筛选得到2929个sg RNA比例下降基因（定义为DOWN基因）,其中包含已知调节ESC自我更新维持的基因。通过对下调基因群体进行GO注释,我们发现该群基因细胞定位主要集中于细胞核。在生物学功能方面,下调基因主要涉及转录调控、细胞周期、细胞分裂和RNA剪接。在分子功能方面,下调基因主要参与蛋白结合。KEGG通路分析表明,下调基因主要集中在代谢通路、核糖体和剪接体。本筛库结果不仅包括已知功能的基因,更重要的是筛选出许多未知基因,这些基因可能在胚胎干细胞自我更新维持中起到重要的调控作用。2.定位于细胞核的DOWN基因生物信息学分析及鉴定我们进一步对下调基因中的细胞核定位基因进行GO注释。KEGG信号通路分析发现,DOWN基因群中细胞定位位于细胞核的基因群体主要集中于剪切体、核糖体生物学及RNA运输条目。为进一步注释ESC自我更新基因并验证筛库结果,我们经过表达谱分析、文献检索等分析步骤将Puf60,U2af2,Wdr75和Usp16这四种基因作为候选靶基因,此四种基因均未在调控ESC自我更新领域有过深入研究。通过感染靶向sg RNA得到Puf60,U2af2,Wdr75和Usp16细胞敲除系。通过形态观察发现,分别敲除靶基因后,细胞形态呈现扁平,松散,趋于分化的状态;通过细胞计数发现,分别敲除靶基因后,细胞数目减少（P＜0.05）。其中敲除Puf60组细胞数目减少最为显著。3.Puf60在ESC自我更新和肿瘤生物学中的功能分析通过EB形成实验结合q PCR实验发现,EB1D、EB3D状态下Puf60的表达含量低于LIF/Serum状态下Puf60的表达含量。通过增加2i/LIF培养条件我们发现,2i/LIF状态下Puf60表达量高于LIF/Serum状态下Puf60的表达含量。在克隆形成实验中,与对照组相比,敲除Puf60后克隆形成率明显降低（P＜0.001）,形态趋于分化型克隆比例明显升高（P＜0.01）,形态维持未分化型克隆比例明显下降（P＜0.01）,提示Puf60敲除后,胚胎干细胞自我更新维持受到影响。本研究进一步分析Puf60对肿瘤形成的影响。Puf60在胆管癌（CHOL）、淋巴样肿瘤弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBC）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、胰腺腺癌（PAAD）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胸腺瘤（THYM）、子宫癌肉瘤（UCS）这九种肿瘤中呈现高表达。其中在卵巢肿瘤中呈现表达含量与转移趋势呈正相关,在子宫肉瘤中与预后相关,且其表达水平与MYC高度相关。综上所述,我们在全基因组水平上筛选调控ESC自我更新的关键基因,将测序结果进行生物信息学分析,挑选靶基因进行功能验证,提示Puf60,U2af2,Wdr75和Usp16参与胚胎干细胞自我更新调节过程,并初步分析Puf60与肿瘤发生的联系,为更好的理解ESC自我更新调控机制提供理论支持,为ESC的临床应用提供基础依据。