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植物离体器官发生(in vitro organogenesis)是指植物由组织或者细胞团(愈伤组织)再分化成根、芽等器官或者离体苗的过程。其理论基础是植物细胞的全能性。DNA甲基化在植物离体器官发生中起重要作用,主要研究集中中全基因组DNA水平的甲基化特征上,而有关基因启动子DNA甲基化研究尚刚刚开始。植物干细胞是一类未分化的细胞,具有维持自身干细胞的特性并进行自我更新,为形成组织器官提供先导细胞的能力。近年来,动物离体干细胞维持与分化相关研究已多有报道,但有关植物干细胞在离体培养下如何维持与分化的研究尚未见报道。离体干细胞与非干细胞分离及其转录组差异比较研究为揭示植物干细胞基本的特征提供了一个新的研究路线。本研究建立了胚性愈伤组织(NC)与单细胞来源的非胚性愈伤组织(S-NRC)的启动子DNA甲基化图谱,比较了二者的甲基化水平差异,并结合二者的转录组信息,筛选了受DNA甲基化调控的离体苗再生相关候选基因,分析了部分候选基因的甲基化水平和表达水平,发现了候选基因PRF的甲基化水平与表达水平呈负相关,且参与了离体苗再生。另一方面,利用拟南芥pCLV3::GFP::GUS转基因植株,建立了干细胞(带有CLV3的GFP荧光信号)和非干细胞(不具有荧光信号)的转录组图谱,筛选了在干细胞特异表达的候选基因,为进一步的深入研究它们在干细胞维持与分化中作用奠定了基础。主要研究过程和成果如下:1拟南芥DNA启动子甲基化对离体苗再生作用研究1.1拟南芥胚性与非胚性愈伤组织的获得拟南芥Col-0种子经愈伤组织诱导、继代培养,获得具有高频率植株再生能力的胚性愈伤组织(RC);实验室已有的非胚性愈伤组织(NRC)经液体悬浮及原生质体培养,形成了多个单细胞克隆,分化培养后发现,每个单细胞克隆均不能再生植株,为单细胞来源的非胚性愈伤组织(S-NRC)。1.2.拟南芥RC与S-NRC的启动子DNA甲基化图谱的建立及其差异比较1.2.1 RC与S-NRC启动子甲基化水平差异比较建立了 RC与S-NRC的启动子甲基化图谱,比较了两者之间启动子甲基化水平差异,发现它们在全基因组水平上有34%的基因启动子甲基化水平存在明显差异。RC和NRC中存在6379个甲基化水平存在差异的基因,其中3150个基因在RC中发生高度甲基化,3229个基因在NRC中发生高度甲基化。1.2.2 DNA甲基化水平差异显著且参与离体苗再生的候选基因筛选筛选出额212个在RC及NRC中DNA甲基化水平差异明显,且可能参与离体苗再生(包括:细胞分化与增殖、植物发育、分生组织建立、细胞周期与分裂、生长素及细胞分裂素响应等信号转导相关基因)的候选基因。1.2.3DNA甲基化图谱与基因表达谱比较及甲基化与基因表达的关系分析利用实验室已建立的RN和S-NRC基因表达谱,结合甲基化图谱,分析了启动子甲基化和基因表达之间的对应关系,筛选出234个启动子甲基化水平与表达水平负相关的基因,其中153个在RC中高度甲基化且表达下调,81个在S-NRC中高度甲基化且表达下调。结合功能注释,发现它们中自有24个基因为发生甲基化且可能参与离体苗再生的候选基因。1.2.4候选基因PRF在离体苗再生中的作用选取在RC中高度甲基化且表达下调的候选基因PRF(Plant Regeneration Factor)进行功能鉴定。对PRF的去甲基化突变体(prf-1、prf-2)的离体苗再生能力分析表明,prf-1、prf-2的离体苗再生能力明显低于Col-0,表明PRF的去甲基化降低了离体苗的再生能力。1.2.5 PRF在愈伤组织继代培养过程中的表达模式为了确定PRF表达水平与愈伤组织的胚性保持的相关性,从拟南芥成熟种子来源的愈伤组织中筛选生长缓慢、松散的愈伤组织(分化能力弱),经连续多代的选择和培养,其分化能力逐渐丧失。对PRF表达模式分析发现,随着愈伤组织分化能力的减弱,PRF的表达水平不断提高,推测愈伤组织的胚性丧失与PRF的高表达相关。1.2.5 PRF沉默表达在NRC恢复再生能力中的作用分析将PRFRNAi载体转入不分化愈伤组织NRC中,转基因愈伤组织经分化培养,发现在其松散结构表面上形成了绿色苗状突起,推测其获得了一定程度的分化能力,表明PRF沉默表达可部分恢复NRC的再生能力。2.拟南芥干细胞分选及转录组分析2.1 拟南芥 pCLV3::GFP::GUS、pWUS::GFP::GUS 和 pSTM::GFP::GUS 胚性愈伤组织的获得建立了拟南芥 pCLV3:GFP::GUS、pWUS::GFP::GUS 和 pSTM::GFP::GUS转基因植株的细胞培养体系。GUS活性分析发现,GLUS信号在pCLV3::GFP::GUS细胞系中表达水平最高,选择pCLV3::GFP::GUS系进行干细胞分选及其转录组测序。2.1拟南芥pCLV3::GFP::GUS愈伤组织原生质体的获得利用荧光流式分选技术,对pCLV3:GFP::GUS细胞系进行了原生质体分离及干细胞分选,筛选出了分选率达到100%的干细胞(带有CLV3的GFP绿色荧光)和非干细胞(不带绿色荧光)。2.2干细胞和非干细胞原生质体转录组测序分析对上述分选出的干细胞和非干细胞原生质体进行转录组测序,结果表明与非干细胞相比,359个基因在干细胞系中特异性上调表达,1328个基因下调表达。GO功能富集分析发现,富集的差异基因分子功能主要为生长因子、NADH脱氢酶活性等,参与的生物学途径主要为转录过程、核糖体合成、RNA甲基化等,基因产物主要位于线粒体内膜、呼吸链等。KEGG富集发现,富集的基因参与了光合作用、光合磷酸化、氧化磷酸化和核糖体和成等过程。进一步筛选到44个与干细胞维持与分化相关的基因,包括27个与激素相关的基因,17个与干细胞相关的基因。