在口腔医学领域，牙槽骨处于终身动态变化中，而外界应力正是这一变化的重要因素之一。特别是在接受各种口腔修复治疗后，牙槽骨的应力变化更加复杂。因此，牙槽骨应力下的变化一直是口腔研究的热点内容。随着细胞生物学的发展，在细胞水平上对骨，特别是牙槽骨的应力改变进行研究已成为一个重要的领域。 成骨细胞是骨形成的主要细胞，它的生物学性能改变直接导致了骨形成过程的变化。同时，成骨细胞还通过与破骨细胞的协同作用参与了骨重建的过程。自从1964年Peck第一次在体外成功培养出成骨细胞后，体外成骨细胞的培养及研究就成为对骨重建研究的一个必要手段。 成骨细胞在应力下的研究，以往多集中于细胞形变后生物学性能的改变，但近年来对生物体生理状态下骨骼系统的研究表明：骨骼系统在生理状态下形变极小，与体外实验需要较大应变才能产生成骨细胞生物学性能改变的情况不同。因此，细胞周围液体流动引起细胞生物性能的改变，已经成为一种共识。在这一理论基础上，流体剪切应力对成骨细胞的作用机理及后果的研究成为近年来对成骨细胞应力作用下变化的重要研究内容。 成骨细胞是如何感受周围应力变化的，又如何在这一信号的改变下对骨重建这一生理过程产生影响?目前，这一领域还没有一个公认的结论。作为细胞与周围环境的中介，胞外基质(EMC)及细胞对胞外基质的主要感受因子整合素，已引起了各学科和研究领域的注意，但成骨细胞整合素在流体剪切应力下的变化还未见报道。同时，作为成骨细胞与破骨细胞的联系纽带因子骨保护素(OPG)及骨保护素配体(OPGL)，也未见其在流体剪切应力下变化的报道。本研究从这两个成骨细胞的重要研究领域着手，期望对成骨细胞对周围信号改变的感应和对破骨细胞的调控研究有所进展。 本研究的主要内容如下： 一.成骨细胞的体外培养及改进 应用两段酶消化法培养原代成骨细胞，利用不同酶的消化能力差异去除成纤维细胞等主要干扰细胞。简化了操作步骤，将以往丢弃的剩余骨片用于组织块培养，在同样取材数量的基础上增大了成骨细胞的数量。利用成骨细胞与成纤维细胞粘附能力的差异，多次沉淀纯化了所得细胞。 通过形态学和组织学的检验，确认所获得细胞为纯正的成骨细胞，单纯消化法和后期组织块法培养的成骨细胞无差异。 二.成骨细胞体外流体剪切应力模型的建立 本实验应用了本研究组自行开发研制的平行流室加力系统。该系统可以精确地调节流体剪切应力值，并同期适时观察细胞形态学变化。本实验利用不同应力下成骨细胞的适时形态学变化和凋亡组织学染色，确定了成骨细胞对流体剪切力的敏感范围，为后续研究打下了基础。 三.成骨细胞整合素β1、αv在流体剪切应力下的变化以往的研究表明，在大鼠成骨细胞上有整合素β1、αv表达，其中β1表达强烈。研究还表明，整合素β1所形成的整合素是胞外基质的主要受体，而整合素αv与骨形成相关，因此本实验选用这两个整合素亚单位作为研究对象。在研究手段上，本实验采用了相对精确的相对定量RT-PCR，保证了研究结果的可靠。结果表明，整合素β1、αv在受到6-18dyn/cm2流体剪切应力的情况下，表达增强，同时与应力值和施力时间呈正相关。而在36dyn/cm2的剪切应力下整合素表达呈下降趋势，并与时间呈负相关。这与形态学的改变相吻合。整合素β1在上述力值范围内的变化幅度明显较整合素αv大，提示我们流体剪切应力对成骨细胞的影响应该主要通过胞外基质的变化实现。 四.成骨细胞骨保护素及其配体在流体剪切力下的变化 骨保护素及骨保护素配体在应力下的变化以往多见于动物实验中。但由于参与因素较多，不能对成骨细胞有明确的意义。骨保护素及其配体又是破骨细胞的主要调控因子之一，本实验将骨保护素及其配体置于同一研究条件，同时研究它们的表达和相互关系。结果表明，骨保护素及其配体在受到6-18dyn/cm2流体剪切应力的情况下，表达均增强，同时与应力值和施力时间呈正相关。但是，在36dyn/cm2的剪切应力下两者表达均呈下降趋势，并与时间呈负相关。这说明骨保护素及其配体存在一定的协同作用。两者之间的比例在6-12dyn/cm2时较为一致，18dyn/cm2力值后骨保护素配体的变化明显大于骨保护素，说明高应力的条件下，骨重建平衡被打破，骨以吸收破环为主。 综上所述，本实验发现，流体剪切应力是成骨细胞的主要应力作用形式，它通过对细胞外基质的作用影响细胞的生物学性能。同时，通过对细胞分泌因子的作用影响下游细胞。