前言　　蜕皮甾酮（ecdysterone，简写EDS），是蜕皮类固醇的一种常见衍生物。除了对无脊椎动物有激素作用外，它对哺乳动物也表现出良好的非激素的生物学作用，例如加强局灶缺血损伤大鼠的血管生成、对地西泮和乙醇所致小鼠记忆障碍的保护作用。本文的目的是探讨EDS是否对短暂前脑缺血再灌注损伤(transientglobalforebrainischemia/reperfusion)的沙土鼠有神经保护作用及其作用机制。　　短暂前脑缺血再灌注损伤是由双侧颈总动脉夹闭术(BCCAO)造成的，予以同时夹闭双侧颈总动脉5分钟，随即再灌注并持续7天。EDS在沙土鼠脑缺血再灌注后立即腹腔注射，并且在接下来的7天存活时间里每天给药1次。　　在脑缺血再灌注后第7天，通过神经功能缺损评分和Morris水迷宫实验评价EDS是否对脑缺血再灌注损伤的沙土鼠具有提高学习及记忆能力的作用。并且通过沙土鼠颈总动脉夹闭处血管HE染色观察，是否BCCAO对血管造成损伤引起血管狭窄或闭塞，导致实验误差。通过Nissl染色和神经元核心抗原(neuron-specificprotein/neuronalnuclei，简写NeuN)免疫组化染色实验结果进行沙土鼠海马CA1区各组间对比有活性神经元的数量变化。进一步通过免疫组织化学染色分析海马CA1区星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GlialFibrillaryAcidicProtein，简写GFAP）阳性细胞和小胶质细胞标志物小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体（ionizedcalciumbindingadaptermolecule-1，简写Iba-1）阳性细胞的数量。以此观察沙土鼠短暂前脑缺血-再灌注损伤后海马CA1区星形胶质细胞和小胶质细胞活化的情况，以及EDS治疗后对其的影响。以激光共聚焦免疫荧光染色实验观察GFAP和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，简写TNF-α)的定位关系。进一步观察EDS治疗后TNF-α的变化情况，观察是否EDS治疗后可以通过影响星形胶质细胞活化情况的变化，从而引起TNF-α这种炎性细胞因子释放的变化。通过进一步的蛋白印迹法实验(WesternBlot)检验脑缺血再灌注是否引起Caspase-3(cysteineasparticacidspecificprotease-3)表达的变化及EDS治疗对其的影响。　　本研究中，我们通过BCCAO法造成沙土鼠短暂前脑缺血-再灌注损伤模型，通过行为学和形态学及分子水平实验手段观察:(1)EDS是否对短暂前脑缺血-再灌注损伤沙土鼠具有减少神经功能缺损和提高其学习记忆能力的神经保护作用;(2)EDS对对短暂前脑缺血-再灌注损伤沙土鼠的神经保护机制是否通过其抑制海马CA1区小胶质细胞和星形胶质细胞活化，从而减少TNF-α等炎性因子的释放，导致Caspase-3活化水平的降低，最终通过减少神经元的凋亡而实现的。　　材料与方法　　40只3月龄健康雄性蒙古沙土鼠，重量在80±10g，随机均分为4组:(1)假手术组(n=10):常规BCCAO操作至分离出双侧颈总动脉但并不夹闭，5分钟后缝合;(2)溶剂对照组(n=10):BCCAO法造模后每日腹腔注射溶剂;(3)EDS低剂量组(n=10):造模后每日腹腔注射低剂量EDS溶剂;(4)EDS高剂量组(n=10):造模后每日腹腔注射高剂量EDS溶剂。溶剂对照组和EDS高低剂量组应用BCCAO法造成沙土鼠短暂前脑缺血再灌注损伤模型。造模后第2天开始进行Morris水迷宫训练。造模第7天进行神经功能缺损评分和Morris水迷宫实验后，断头处死动物取材，半脑固定半脑冻藏，同时留取颈总动脉夹闭段固定。制备沙土鼠半脑和颈总动脉冰冻切片。颈总动脉进行HE染色。半脑切片进行Nissl染色、TUNEL染色，以及NeuN、GFAP、Iba-1、TNF-α免疫组织化学染色和TNF-α与GFAP双重免疫荧光标记的共聚焦实验。冻藏海马区脑组织行Caspase-3的WesternBlot实验。应用细胞计数统计方法统计切片免疫组化染色结果。采用SPSS16.0统计软件作数据处理分析。神经功能缺损评分应用多组间均数比较的非参数KruskaWalli检验。Morris水迷宫结果和其他组化结果数据各组计量资料均以均数加减标准差表示，多因素重复测量方差分析比较各组之间指标变化，组间对比应用t检验分析，P＜0.01认为有显著性差异。　　实验结果　　1、颈总动脉HE染色结果　　夹闭处颈总动脉管壁各层无损伤，未发现血管狭窄或血栓形成。可以排除由于颈总动脉夹闭造成损伤而导致血管狭窄或闭塞，引起永久性缺血，而导致实验误差的可能。　　2、行为学——神经功能缺损评分和Morris水迷宫　　EDS高低剂量治疗组相比溶剂对照组，都明显降低了神经功能缺损分数。　　在造模后第2天和第3天的可视平台实验中，假手术组、高剂量组、低剂量组和溶剂对照组沙土鼠的平均逃避潜伏期及搜索的平均路程呈逐渐下降趋势。在造模后第5天到第7天的隐蔽平台实验中，各组沙土鼠搜索平台的潜伏期及找到平台所经过的路程随游泳次数增多呈下降趋势。统计结果显示，溶剂对照组沙土鼠搜索平台潜伏期及找到平台所经过路程与假手术组沙土鼠相比，二者均明显延长，具有显著的统计学意义(P＜0.01)，而高低治疗组的搜索平台的潜伏期及找到平台所经过的路程则明显低于溶剂对照组沙土鼠，有统计学意义。在空间探索实验中，60s内对溶剂照组沙土鼠经过相应平台位置的次数明显低于假手术组，而EDS高低剂量治疗组沙土鼠则高于溶剂对照组。　　3、Nissl染色结果　　与假手术组对比，溶剂对照组海马CA1区有活性神经元数目显著减少。相反，与溶剂对照组相比，EDS高剂量治疗组(50mg/kg)显著缓解脑缺血损伤引起的尼氏染色阳性细胞的缺失(P＜0.01)。　　4、NeuN免疫组织化学染色结果　　NeuN免疫组织化学染色结果与尼氏染色的结果基本一致。与溶剂组相比，EDS治疗组能显著增加NeuN免疫组化阳性细胞的数量。　　5、TUNEL染色结果　　假手术组沙土鼠在海马CA1区仅见少量TUNEL阳性反应细胞;短暂前脑缺血-再灌注7dayEDS治疗组沙土鼠海马CA1区锥体细胞内呈深棕色的TUNEL阳性细胞数目明显较溶剂对照组减少。溶剂对照组海马CA1区TUNEL阳性细胞数与EDS治疗组之间比较有显著性差异(P＜0.01)。　　6、GFAP和Iba-1免疫组织化学染色结果　　脑缺血后，沙土鼠海马CA1区GFAP和Iba-1免疫组织化学阳性细胞显著增多，而EDS治疗后，却相应减少。　　7、TNF-α免疫组织化学染色结果　　溶剂对照组TNF-α免疫组织化学阳性细胞的数量较假手术组显著增加，应用EDS治疗后可以明显减少。　　8、激光共聚焦染色结果　　双重免疫荧光标记显示TNF-α免疫阳性细胞同时对抗GFAP抗体呈阳性反应。　　9、Westernblot检测Caspase-3蛋白表达结果　　应用EDS治疗后有活性的Caspase-3表达水平较溶剂对照组显著下降。　　讨论　　在本研究中，通过BCCAO法造成沙土鼠短暂前脑缺血-再灌注损伤模型，应用EDS治疗后与溶剂对照组比较，通过行为学、形态学和分子水平实验研究EDS的神经保护作用及其作用机制。　　通过神经功能缺损评分，我们观察到:短暂前脑缺血再灌注损伤后，溶剂对照组沙土鼠较假手术组动物表现出明显的神经功能缺损，并具有统计学意义。而EDS治疗后则可明显缓解这种神经功能缺损。进一步通过Morris水迷宫的定位巡航实验和空间探索实验，我们证实EDS对沙土鼠前脑缺血-再灌注损伤后学习记忆能力的下降具有明显的治疗作用。由于学习与记忆的完成主要需要海马区神经元的支配作用，通过对海马CA1区各组间Nissl染色和NeuN免疫组化染色观察活性神经元的数量、TUNEL染色观察凋亡神经元的情况，我们知道EDS的神经保护作用可能是通过减少神经元的凋亡、保留活性神经元的数量而实现的。　　由短暂前脑缺血再灌注损伤引起的TNF-α释放增多，通过EDS(20mg/kg和50mg/kg)治疗得到了明显改善。由这些结果可推断出EDS发挥神经保护作用是通过其抗炎症反应的特性而发挥的。通过激光共聚焦免疫荧光实验得出结论，在TNF-α和GFAP的组织化学免疫阳性细胞共定位。GFAP作为星形胶质细胞的特征性标志物与这TNF-α这种炎性因子共定位说明，前脑缺血引起星形胶质细胞活化，使其大量释放TNF-α。我们的研究证实前脑缺血再灌注损伤后，沙土鼠海马CA1区Iba-1阳性细胞数量和GFAP阳性细胞数量明显增多，说明小胶质细胞和星形胶质细胞在缺血后活化。虽然星形胶质细胞和小胶质细胞在缺血后以相似的模式活化，它们不但发挥不同的作用，而且在缺血后不同的时间阶段和区域发挥作用。小胶质细胞较星形胶质细胞更早地释放IL-1β和TNF-α，以至于我们还没有通过实验观察到这个过程就结束了。而EDS可以减少前脑缺血-再灌注损伤后海马CA1区星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，而进一步减少TNF-α的表达，从而抑制炎症反应。但是，我们还不清楚EDS发挥抗炎症反应的作用，是单独通过其抗氧化能力还是通过抑制胶质细胞活化而发挥的。　　脑缺血损伤后，发生相应部位为主的氧化应激反应和/或线粒体功能紊乱，最终导致凋亡级联反应激活，引起神经损伤。Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一类蛋白酶家族，具有类似的结构并存在于细胞质中，在细胞凋亡的启动和执行中都发挥重要作用。Caspase有两类，起始Caspase在凋亡刺激物的作用下被切割激活，其对执行Caspase进行切割使其激活，然后通过对Caspase靶蛋白的水解最终导致程序性细胞死亡。在已被人们发现的10余种Caspase中，Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用。Pro-Caspase-3在活化过程中被剪切成两种亚基后再组成具有活性形式的Caspase-3而进而引起凋亡。大量的实验研究证实脑缺血后引起Caspase-3的上调。我们的实验也得出结论，前脑缺血再灌注损伤后，通过EDS治疗不但可以明显降低沙土鼠海马CA1区Caspase-3的表达，而且可以抑制它的活化，从而发挥神经保护的作用。　　结论　　1、BCCAO方法造成沙土鼠短暂前脑缺血-再灌注损伤模型未对血管造成副损伤。　　2、EDS可明显减少短暂前脑缺血-再灌注损伤沙土鼠的神经功能缺损。　　3、EDS可显著改善短暂前脑缺血-再灌注损伤沙土鼠空间学习记忆能力的障碍。　　4、EDS可以减少由短暂前脑缺血-再灌注损伤引起的沙土鼠海马CA1区迟发性神经元凋亡，从而增加存活正常功能神经元的数量。　　5、EDS可以抑制由短暂前脑缺血-再灌注损伤引起的星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，从而抑制炎症反应。　　6、EDS可以抑制由脑内炎症反应引起星形胶质细胞的活化后炎性因子TNF-α的释放。　　7、EDS可以通过减少TNF-α的表达，而进一步减少海马CA1区Caspase-3的活化，从而减弱神经元的凋亡而起到脑缺血后神经保护的作用。