实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光探针或者荧光染料,利用荧光信号的积累,实时监测整个PCR的反映进程,通过制作出的标准曲线,对未知模版进行定量分析。因其具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点,被广泛应用于分子诊断、分子生物研究、动物及食品安全检测等方面。本实验分离了犬全血中的外周血淋巴细胞,通过PCR成功扩增出IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等几种细胞免疫因子的基因片段,连接pMD-18T载体,转化到DH5α感受态细胞中,在Amp抗性培养基上进行筛选、PCR和测序等验证,构建了标准品质粒。最后成功建立了检测犬全血中IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等细胞因子的实时荧光定量PCR的方法,该方法的模版在102~108拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2均达到0.992以上。利用该方法对犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)三联活疫苗免疫比格犬后的细胞免疫水平进行了评价。实验结果显示:犬三联活疫苗免疫犬后,免疫犬外周血淋巴细胞与空白对照外周血淋巴细胞相比,IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等几种细胞免疫因子mRNA水平在3~14天之间均显著升高(p<0.05);空白对照组的4种细胞免疫因子mRNA水平没有明显差异(p>0.05)。以上实验结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法确实可行,IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等细胞免疫因子可以作为细胞免疫评价指标之一。