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灰霉病是由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的一种重要病害,是番茄、辣椒和茄子等茄科作物上的主要病害之一。由于灰葡萄孢菌在遗传上存在异核现象,在自然种群中存在十分丰富的多样性,在药剂选择压作用下,自然存在的抗药性个体极易被筛选而形成抗药性的亚群体,从而导致防治效果下降甚至失效的局面。在众多用于灰霉病化学防治的药剂中,以嘧霉胺(pyrimethanil)为代表的苯胺基嘧啶类杀菌剂是目前应用于灰霉病防治的重要杀菌剂之一。虽然嘧霉胺在国内使用年限不长,但是由于其作用位点单一,田间抗药性已有陆续的报道。为了更有效的控制灰霉病害,延长药剂的使用年限,有必要对药剂的抗性现状和抗性菌株的适应性进行研究。
本研究采用菌丝生长速率法,选用组合培养基(Chapenlnd,1999)测定了来自浙江宁波、金华、嘉兴等不同地区保护地蔬菜上采集分离的48个灰霉病菌菌株对嘧霉胺的抗性,发现高抗菌株4个(占8.33%),中抗菌株2个(占4.17%),低抗菌株6个(占12.5%),敏感菌株36个(占75%)。抗性菌株在无药培养基上经10代继代培养后,再进行抗性评价,发现其抗嘧霉胺特性能稳定遗传。
选取对嘧霉胺敏感性不同的灰葡萄孢菌菌株BC-T-4-28(S)、BC-T-4-69(MR)和BC-T-1-37(HR),分别对这些菌株的菌丝扩展速率、菌丝干重、产孢和胞外酶(果胶酶和纤维素酶)活性等生理生化指标进行了比较。结果表明:不同敏感性的灰霉菌株之间菌丝扩展速率、菌丝干重和产孢量,随着抗性的增加都有一定程度的减小。对不同敏感性的灰葡萄孢菌菌株的致病性的研究也表明,敏感性不同的灰葡萄孢菌菌株之间致病性随抗药性的增加也有一定程度的减少。通过对果胶酶和纤维素酶活性的测定,我们得到抗性不同的灰霉菌株果胶酶活力和纤维素酶活力随着抗性的增加酶活力都呈减小趋势,这一结果与嘧霉胺的抑制之一抑制病菌胞外酶分泌相一致。
众多研究报道表明,灰霉病菌株系间存在较大遗传学差异和形态学上的差异。灰葡萄孢至少由两种不同的同域亲缘种(sympatricsiblingspecies)组成,区别是转位因子Boty和Flipper的有无。含有转座子Boty和Flipper的称为transposa,不含转座子的称为vacuma,transposa和vacuma菌株间可发生遗传重组。本研究试图分析灰葡萄孢菌的转位因子在中国的灰葡萄菌中是否也存在,他们的存在方式,他们的存在与地域和灰霉菌对嘧霉胺抗性之间是否存在相关性。本研究对123个灰霉菌株进行单孢分离并提取基因组DNA,根据已经报道的Boty和Flipper序列设计合成引物,扩增该两个片断。结果表明6.5%的菌株只含有Boty,25.2%菌株只含有Flipper,43.1%的菌株同时含有Boty和Flipper两个转位因子,25.2%的菌株不含Boty和Flipper两个转位因子。以其中一个含有两种转位因子的灰霉菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增并对PCR产物进行测序,测序结果在NCBI上进行比对,结果表明:所得的片断Boty和Flipper分别与Diole等2002年登陆的BCBOTYPOL和Levis等2005年登陆的BFU74294的相似度达到98%和98%。将PCR扩增结果与菌株的采集地点和对嘧霉胺的抗性测定结果进行比较,结果表明转位因子Boty和Flipper的有无与菌株的地理分布没有相关性,和菌株对嘧霉胺的抗药性也没有相关性。