地西泮（Diazepam,DZP）是一种常见的镇静催眠药,若给畜禽食用可提高出肉率进而提高经济利润,地西泮目前虽被列为禁用兽药,但仍有养殖企业为了高额利润将地西泮用在畜禽生产当中。目前地西泮的残留检测方法有多种,常用的有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）,这些方法都可用于地西泮残留检测,但是也有前处理时间长且复杂、检测成本高、对操作人员知识储备和专业要求严格、不方便大量检测和移动困难等缺点,而ELISA方法操作简便、检测成本低、特异性强、灵敏度高,适合于大批量样品的快速有效测定,不局限于实验室检测,比以上几种方法更适合于普遍推广。本实验的目的是能够对间接竞争ELISA方法的建立及条件优化流程有一个比较清晰地认识,能够独立进行实验并进行实例应用,并对所建立的方法进行评估,为研究地西泮免疫分析方法以及研制ELISA检测试剂盒奠定基础。1.地西泮间接竞争ELISA检测方法的建立。建立间接竞争ELISA方法时逆向开始测定并对实验条件进行适当优化,测定酶标二抗的最适工作浓度是1:50000,得到最适显色时间是15 min,最佳包被条件是4℃包被过夜,最适封闭条件是37℃封闭90 min,以DZP-BSA作为包被原,利用棋盘法测得包被原最佳工作浓度是1:10000,抗体的最佳工作浓度是1:10000。用地西泮标准品做药物抑制标准曲线,得出线性方程是y=A2+（A1-A2）/[1+（x/x0）^p],R²=0.998,半数抑制浓度即IC₅₀是1.667 ng/mL,检测范围是0.194 ng/mL¹4.364 ng/mL。2.地西泮单克隆抗体间接竞争ELISA方法的评估。检测了30种与DZP结构式相似的苯二氮卓类药物与DZP的交叉反应率,最终得出7种有交叉反应的药物,分别是替马西泮（Temazepam）、甲硝西泮（Nimetazepam）、氯硝西泮（Clonazepam）、2-羟乙基氟西泮（2-Hydroxyethylflurazepam）、四氢西泮（Tetrazepam）、阿普唑仑（Alprazolam）、普拉西泮（Prazepam）,利眠宁的交叉反应率是1.236%,其余22种药物的交叉反应率极低（低于0.1%）。利用建立的间接竞争ELISA检测方法,对猪尿中的地西泮残留进行检测,新鲜猪尿离心,弃去尿沉渣用上清液做检测,用前面测得的抗原抗体最佳工作浓度进行测定,测定完成后计算得出猪尿中的添加回收率在91.4%¹03.70%,批内变异系数（CV）是1.98%⁵.06%,批间变异系数（CV）是4.87%⁸.22%,检测限是0.307 ng/mL。结论是建立了DZP单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法,优化了部分实验条件,并成功应用于猪尿中的地西泮残留检测。