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暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela Motschulsky），属鞘翅目、金龟科，是分布广泛的重要地下害虫。幼虫统称为蛴螬，主要为害花生、马铃薯、山药等作物，其中花生因蛴螬危害一般减产10％~30％，严重时减产60％~70％，甚至绝产，并造成花生品质下降，严重制约着我国花生生产。昆虫围食膜（Peritrophic membrane，PM）是昆虫天然的的物理屏障，是害虫防治的靶标。因此分离鉴定新的靶标蛋白基因及其表达分析，为进一步研究靶标蛋白与杀虫活性物质作用的分子机制和探索环境友好型杀虫剂控制蛴螬危害提供基础。本研究通过构建暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA文库，利用免疫筛选文库的方法，获得了350个阳性克隆，对其中3个编码PM蛋白的cDNA进行了分析，并初步研究了Cry8Ea3蛋白对hpcda5表达在转录水平上的影响。提取暗黑鳃金龟（H. parallela）幼虫中肠总RNA，分离得到mRNA，反转录获得cDNA，利用Uni-ZAP XR载体，成功构建了高质量的暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。该cDNA文库滴度为4.68×105pfu/mL，重组率为98.8%，扩增后文库滴度达1.8×108pfu/mL，插入cDNA片段的平均大小为1.8kb。用围食膜蛋白多克隆抗体分别对该文库进行免疫筛选，共得到350个阳性克隆，经测序后生物信息学分析得到3个全长基因hpcbp45、hpcda5、hpce19，分别编码HpCBP45、HpCDA5和HpCE19蛋白。分离获得了编码围食膜几丁质结合蛋白的cDNA基因hpcbp45。该基因ORF为1923bp，编码641个氨基酸。其编码的蛋白HpCBP45N-端具有21个氨基酸的信号肽序列，预期蛋白分子量为69.5kDa，等电点为4.29。包含8个具有peritrophin-A结构特征的几丁质结合功能域（chitin binding domain，CBD）和3个N-联糖基化位点，氨基酸序列可以用通式CX13-20-CX5-CX9-CX12-CX7-C表示（X代表除半胱氨酸之外的其他氨基酸残基），其中多个CBD的存在有利于蛋白质-几丁质结合结构的稳定。hpcbp45基因在原核细胞中成功表达了与预期一致的69.5kDa融合蛋白，在真核酵母表达系统中由于糖基化作用，表达的重组蛋白HpCBP45分子量约100kDa，高于预测分子量。几丁质结合活性实验表明HpCBP45具有很强的几丁质结合活性，只能被6M尿素和1%calcofluor洗脱，属于class3类PM蛋白。实时定量PCR实验结果显示hpcbp45基因在中肠中表达量最高，说明该类围食膜是由中肠分泌，属于TypeⅠ型PM。分离得到编码暗黑鳃金龟幼虫羧酸酯酶的cDNA基因hpce19，该基因ORF为1605bp，编码534个氨基酸，预期蛋白分子量为59.2kDa，等电点为4.19。经NCBI网站Conserved Domain Database（CDD）分析表明，其编码的HpCE19蛋白序列包含有Esterase/lipase superfamily（酯酶/脂肪酶超家族）的保守结构域。经ExPASyProteomics Server网站ScanProsite分析，含羧酸酯酶B型丝氨酸活性位点FGGdpnkVtLaGySAG。ExPASy Proteomics Server网站SWISS-MODEL预测其蛋白质三级结构，并经Pfam网站分析其蛋白活性中心包括3个氨基酸残基（催化三联体：Ser203，Asp334，His438）。NetNGlyc1.0Server预测在第257、408和448位氨基酸分别含有N-联糖基化位点。hpce19在毕赤酵母GS115中得到成功表达，表达59kDa左右的目的蛋白，与预期一致。以α-醋酸萘酯溶液为底物检测HpCE19活性显示平均酶活力为0.21mmol/100μL酶液。实时定量PCR表明羧酸酯酶基因hpce19在中肠中表达量最高，推测与昆虫产生抗药性相关。筛选得到了编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpCDA5的cDNA基因hpcda5，该基因ORF为1107bp，编码379个氨基酸，预期蛋白分子量为42.2kDa，等电点为4.08；信号肽软件分析发现N-端具有19个氨基酸的信号肽序列。氨基酸序列分析表明HpCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域和1个N-联糖基化位点。Blast结果显示其氨基酸序列与赤拟谷盗几丁质脱乙酰酶具有较高的相似性。hpcda5基因在原核细胞中获得成功表达，表达约42kDa的目的蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-hpcda5，转染昆虫细胞sf9，分别获得P1、P2、P3病毒，检测P3病毒证明hpcda5在昆虫细胞sf9中获得成功表达。几丁质结合活性实验结果表明HpCDA5蛋白具有几丁质结合活性。实时定量PCR结果显示hpcda5基因在卵中表达量最高，在脂肪体和蜕中表达量较高，而在头部则不表达。RT-PCR检测饲喂Cry8Ea3蛋白后hpcda5基因的表达变化，结果表明喂食Cry8Ea3蛋白后6h，hpcda5基因表达量显著增高，8h之后恢复正常水平，表明饲喂Cry蛋白可以引起hpcda5基因表达在转录水平上调。