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本实验目的是观察AG对TGF-β1诱导体外肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞表达CTGF、α-SMA的影响,为AG治疗肺纤维化机制的研究提供实验资料。
研究方法:
1.动物处理:选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,一次性气管内滴注BLMA5(5mg/kg)复制大鼠肺纤维化模型,于给药后第14天处死动物。
2.细胞培养:采用组织块法培养大鼠肺成纤维细胞,培养条件:RPMI1640培养液(含10%小牛血清)10ml、5%CO2、37℃,第4代细胞用于实验。
3.MTT法选择TGF-β1和AG的适宜浓度:将细胞悬液(细胞浓度为2×105个/ml)滴注于96孔板中,培养24小时后,分别加入不同浓度的TGF-β1(1、10、20ng/ml)和AG(20、100、500μM),刺激24小时后测定细胞MTT活力,根据以上结果及参考文献选择TGF-β1和AG的适宜浓度。
4.细胞分组:成纤维细胞分为4个组:①Sham组、②TGF-β1组(浓度10ng/ml)、③AG+TGF-β1组(AG浓度500μM、TGF-β1浓度10ng/ml)、④AG组(浓度500μM)。
5.细胞免疫化学染色:将细胞悬液滴种于24孔板中,细胞浓度为2×105个/ml,每孔加液1ml,进行细胞爬片。加入各组药物24小时后,用免疫细胞化学染色技术检测CTGF、α-SMA阳性细胞。
6.流式细胞仪检测肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞表达α-SMA。
7.统计学处理:实验数据用均数±标准差((-x)±SD)表示,采用SPSS-11.5统计软件包,多个样本均数比较用单因素方差分析(One-WayANOVA),多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(leastsignificantdifference,LSD);以P<0.05作为判断差异显著性的标准。
研究结果:
1.MTT法选择药物浓度。TGF-β1(1、10、20ng/ml)及AG(20μM、100μM、500μM)各药物浓度组与不加药组相比,其差异均无统计学意义(P>0.05),说明所选药物浓度对肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞无药物毒性。
2.肺成纤维细胞CTGF免疫细胞化学染色结果。TGF-β1诱导成纤维细胞表达CTGF的阳性细胞百分率(62.6±2.4%)、平均光密度值(平均OD值)(0.37±0.02)与Sham组(20.1±3.8%、0.29±0.02)比较,显著性增加(P<0.01)。AG+TGF-β1组与TGF-β1组相比,CTGF阳性细胞百分率(57.4±3.8%)、平均OD值(0.35±0.02)均显著性降低(P<0.05);而与Sham组相比,仍然较高(P<0.01)。AG组CTGF阳性细胞百分率(21.3±3.2%)、平均OD值(0.30±0.02)与Sham组相比,均无显著性差异(P>0.05)。
3.肺成纤维细胞α-SMA免疫细胞化学染色结果。TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA的阳性细胞百分率(63.1±3.6%)、平均OD值(0.38±0.02)与Sham组(21.3±4.3%、0.30±0.01)比较,显著性增加(P<0.01)。AG+TGF-β1组与TGF-β1组相比,α-SMA阳性细胞百分率(58.3±4.5%)、平均OD值(0.35±0.01)均显著性降低(P<0.05);而与Sham组相比,仍然较高(P<0.01)。AG组α-SMA阳性细胞百分率(22.7±4.5%)、平均OD值(0.30±0.01)与Sham组相比,均无统计学意义(P>0.05)。以上免疫细胞化学结果综合分析:AG单独作用不影响成纤维细胞表达CTGF、α-SMA,但是AG能够减弱TGF-β1诱导肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞表达CTGF、α-SMA的作用。
4.流式细胞仪检测肺成纤维细胞表达α-SMA(以均道值表示)。Sham组均道值为516±5.6,TGF-β1组均道值(580±13.0)明显高于Sham组(P<0.01)。AG+TGF-β1组均道值(544±10.6)与Sham组相比,呈显著性增加(P<0.05);与TGF-β1组相比,呈显著性降低(P<0.05)。AG组(526±19.3)与Sham组相比,无显著性差异(P>0.05)。
研究结论:
1.TGF-β1诱导肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞表达CTGF;促进肺成纤维细胞向MF的分化。
2.AG减少TGF-β1诱导肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞表达CTGF;抑制肺成纤维细胞向MF的分化。