研究背景和研究目的结直肠癌是全世界常见的恶性肿瘤之一。在中国,结直肠癌的发病率位居恶性肿瘤第五位,其发病率呈逐年上升的趋势。转移是结直肠癌复发和死亡的主要原因,而临床上很多结直肠癌患者在接受手术之前已经发生了微转移。因此,找到有效预防和治疗结直肠癌转移的新方法是当今肿瘤学研究的一项迫切任务。人DOC-2/DAB2相互作用蛋白基因(DAB2IP),又称为ASK1相互作用蛋白(AIP1),是最近发现的RasGAP家族的一个新成员,它位于9q33.1-q33.3染色体。DAB2IP直接与DAB2(也被称为DOC-2)的N端区域相互作用,形成一个独特的蛋白复合体,并对Ras介导的信号通路起负向调控作用。近来研究表明,DAB2IP在人类多种癌组织中表达下调,并受表观遗传学调控如DNA甲基化和/或组蛋白修饰。此外,DAB2IP参与调控肿瘤生长和转移过程。DAB2IP通过Ras-GAP活性,抑制Ras调节的细胞信号通路,导致细胞生长受到抑制。DAB2IP通过精确调节Ras和NF-Kb信号通路,抑制前列腺癌的生长和转移。DAB2IP还可诱导前列腺癌中MET的发生,该机制是通过募集PP2A与GSK-3β相互结合,从而降解胞浆内(3-catenin而实现的。DAB2IP通过VEGFR-3调节肿瘤血管和淋巴管生成。本课题组研究还发现DAB2IP表达下调与肝癌的演进和预后不良密切相关。目前有关DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的转录调控及作用机制尚不清楚。本研究将揭示结直肠癌中DAB2IP基因的转录调控及组蛋白修饰新机制,探讨Snail/DAB2IP正反馈通路对结直肠癌增殖、EMT、侵袭及转移的影响,检测Snail/DAB2IP正反馈轴在结直肠癌组织中的表达及预后价值；旨在阐明DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制,为结直肠癌转移的早期预警、预后评估提供潜在应用靶点。研究方法1. DAB2IP沉默对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响1)利用Real-Time PCR和Western blot检测8种结直肠癌细胞株DAB2IP的表达。2) DAB2IP的CDS区3399bp,上下游GC含量差异较大,多次构建DAB2IP过表达载体均失败。采用慢病毒感染的方法构建稳定干扰DAB2IP细胞株(SW480/SiDAB2IP-1/-2、HCT116/SiDAB2IP-1/-2)和对照细胞株(SW480/NC、 HCT116/NC),并使用Real-Time PCR和Western blot鉴定其干扰效率。3)采用MTT、平板克隆形成实验、流式检测周期、凋亡实验检测干扰DAB2IP后对细胞增殖能力、克隆形成能力、周期和凋亡的影响；采用细胞粘附实验检测干扰DAB2IP后对细胞粘附能力的影响；采用小室迁移实验,小室侵袭实验、Western blot和免疫荧光实验检测干扰DAB2IP后对细胞的迁移、侵袭能力及EMT相关分子的影响。采用细胞球形成实验、Western blot检测干扰DAB2IP后对细胞的干性的影响。4)采用裸鼠皮下成瘤实验、肿瘤细胞尾静脉注射实验观察干扰DAB2IP后对结直肠癌细胞在裸鼠体内成瘤能力、侵袭及转移能力的影响。2. Snail负向转录调控DAB2IP1)利用软件预测转录因子Snail在DAB2IP启动子潜在结合位点。2)利用双荧光素酶报告系统和CHIP实验检钡Snail的确切结合部位及对DAB2IP转录活性影响。3)利用、Vestern blot检测干扰和过表达Snail对DAB2IP蛋白表达的影响。3. EZH2-HDAC1/HDAC2-Snail线性复合物对DAB2IP的表达调控1)构建EZH2基因过表达载体和EZH2基因set区域缺失载体EZH2Δset,利用Western blot实验筛选EZH2干扰片段2)利用、Vestern blot检测过表达EZH2和干扰EZH2检测DAB2IP的表达。3)利用Western blot检测EZH2、EZH2Δset、乙酰化酶抑制剂TSA处理后EZH2、H3、H3K27me3、DAB2IP的变化。4)利用免疫共沉淀实验检测EZH2、HDAC1/HDAC2、Snail三者之间是否可以形成复合物。5)利用Western blot检测干扰Snail对EZH2沉默DAB2IP的影响。6)利用双荧光素酶实验检测干扰EZH、HDAC1、HDAC2、Snail及表达EZH2对DAB2IP启动子活性的影响。7)利用免疫共沉淀实验检测干扰HDAC1、HDAC2或TSA刺激后,EZH2与Snail的结合能力。8)利用免疫共沉淀实验检测TAS刺激后,EZH2、Snail与HDAC1/HDAC2之间结合能力的改变。9)利用双荧光素酶实验检测TSA刺激对DAB2IP启动子活性的影响。4. Snail和DAB2IP之间形成正反馈环路1)利用Western blot检测干扰DAB2IP对p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、 β-catenin表达影响,免疫荧光检测Snail、p-catenin表达及定位,双荧光素酶实验检测干扰DAB2IP对β-catenin/TCF和DAB2IP启动子转录活性影响。2)采用慢病毒感染的方法构建稳定SiSnail和SiSnail/SiDAB2IP细胞株,并使用Western blot检测Snail、DAB2IP的表达。3)利用Western blot检测SiSnail、SiSnail/siDAB2IP、SiSnail+LiCL (GSK-3p抑制剂)、SiSnail+MG132(蛋白酶体抑制剂)处理对Snail、DAB2IP、p-GSK-3β、 GSK-3β、p-catenin表达的影响,4)利用双荧光素酶实验检测SiSnail、SiSnail/SiDAB2IP、SiSnail+LiCL、 SiSnail+MG132处理对β-catenin/TCF、DAB2IP启动子转录活性的影响,5. DAB2IP对Snail诱导的结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响1)采用MTT、平板克隆形成实验检测SiSnail、SiDAB2IP/SiSnail处理对细胞的迁移、侵袭能力、EMT相关分子的影响。2)采用迁移、侵袭实验检测SiSnail、SiDAB2IP/SiSnail处理对细胞的迁移、侵袭能力、EMT相关分子的影响。3)采用裸鼠皮下成瘤实验、肿瘤细胞尾静脉注射实验观察SiSnail、 SiDAB2IP/SiSnail处理对结直肠癌细胞裸鼠体内的成瘤能力及转移能力的影响。6. DAB2IP在结直肠癌组织中的表达与预后价值1)利用Real-Time PCR检测20对配对肠癌和癌旁正常组织中DAB2IPmRNA表达水平。2)利用Western blot检测8对配对肠癌和癌旁正常组织中Snail、DAB2IP的蛋白表达,并分析其相关性。3)利用免疫组化分别检测DAB2IP、EZH2在200例或120例结直肠癌组织、配对正常肠粘膜、配对淋巴结转移灶中的表达,并采用SPSS13.0A软件分析二者表达相关性、DAB2IP表达与临床病理因素的相关性及其对预后的影响。研究结果1. DAB2IP沉默对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响1) Real-Time PCR和Western blot检测结果显示,高转移结直肠癌细胞株SW620和LOVO细胞株DAB2IPmRNA和蛋白表达表达较低(F=6.664,P=0.001)。2) Real-Time PCR和Western blot检测证明成功构建DAB2IP稳定沉默结直肠癌细胞株SW480/SiDAB2IP-1/-2、HCT116/SiDAB2IP-1/-2以及其阴性对照细胞株SW480/NC、HCT116/NC(Real-Time-PCR SW480:F=404.920, P=0.000;HCT116:F=1756.099, P=0.000)。3)MTT细胞增殖实验、平板克隆实验表明,与对照细胞比,干扰DAB2IP增强结直肠癌细胞体外增殖能力(SW480:F=12.487, P=0.000; HCT116:F=34.931,P=0.000)和克隆能力(SW480:F=52.000,P=0.000;HCT116:F=37.186, P=0.000)。4)迁移实验和侵袭实验表明,与对照组相比较,干扰DAB2IP增强结直肠癌细胞体外迁移(SW480:F=413.872, P=0.000; HCT116:F=234.832, P=0.000)和侵袭能力(SW480:F=49.306, P=0.000; HCT116:F=240.050, P=0.000)。5)细胞周期实验表明,与对照组相比较,干扰DAB2IP后结直肠癌细胞体G1期细胞数目减少,G2和S期细胞数目增力(SW480:G1F=409.814, P=0.000, G2F=8.493, P=0.000, SF=63.672, P=0.000; HCT116:G1F=179.890, P=0.000, G2F=66.639, P=0.000, SF=41.639, P=0.000)。6)细胞凋亡实验表明,与对照组相比较,干扰DAB2IP对结直肠癌细胞的凋亡率无影响。(SW480:F=0.007, P=0.993; HCT116:F=0.063, P=0.940)7)FN粘附实验表明,与对照细胞比,干扰DAB2IP对细胞异质粘附能力无影响(SW480:F=0.820, P=0.456; HCT116:F=1.223, P=0.318)。8)细胞成球实验和Western blot检测干细胞标记,与对照组细胞比,干扰DAB2IP结直肠癌细胞干性没有明显改变(SW480:F=0.916, P=0.450; HCT116: F=0.124, P=0.886)。9) Western blot和免疫荧光检测EMT相关分子标志物的表达,结果发现和对照组细胞比,DAB2IP干扰后上皮标志物E-Cadherin、α-Catenin表达下降,而间叶标志物Vimentin表达升高。10)裸鼠皮下成瘤实验和尾静脉注射实验表明,与对照相比较,干扰DAB2IP增强了结直肠癌细胞的体内成瘤能力(SW480:F=2.480, P=0.019; HCT116:F=2.700,P=0.011)、侵袭能力和肺转移能力(SW480:F=5.316, P=0.018)。以上结果显示：干扰DAB2IP可以促进结直肠癌细胞体内外生长、增殖、EMT、侵袭及转移能力。2.预测并验证Snail转录调控DAB2IP1)通过Ensembl数据库,在线获得编码DAB2IP前体序列所在基因的上游lkb作为DAB2IP的启动子序列.利用三种在线软件Mapper2、Consite、TRED,预测及分析可能与DAB2IP启动子结合的转录因子,综合考虑选择Snail作为DAB2IP的转录因子,并预测有两个结合位点,分别命名为CHIP1(151bp-156bp)和CHIP2(321bp-326bp)。2) Western blot结果表明,在SW480和HCT116细胞株中瞬时干扰和过表达Snail后DAB2IP的表达分别发生了上调和下调,证明Snail抑制DAB2IP的表达。3)双荧光素酶报告基因实验结果表明,当SW480、HCT116细胞及HEK293A细胞转染PGL3-Basic-DAB2IP-promoter与转染PGL3-Basic相比其荧光素酶活性减弱(P<0.001; P<0.001, P)说明DAB2IP启动子序列具有有启动转录活性。当共转染PGL3-Basic-DAB2IP-promoter和pEGFP-Snail质粒时,与单独转染PGL3-Basic-DAB2IP-promoter相比,其荧光素酶活性进一步减弱(P<0.001; P<0.001),进一步说明Snail能抑制DAB2IP启动子的转录活性。4)染色质免疫共沉淀试验证明,转录因子Snail结合在DAB2IP启动子的CHIP1区域(151bp-156bp)。以上结果显示：转录因子Snail与DAB2IP的启动子CHIP1区域(151bp-156bp)结合并抑制其转录活性。3. EZH2-HDAC1/HDAC2-Snail线性复合物对DAB2IP的表达调控1)过表达和干扰EZH2后DAB2IP分别发生了下调和上调。2)EZH2能上调H3K27me3的表达,下调DAB2IP的表达,然而EZH2Δset对H3K27me3、DAB2IP表达无作用；脱乙酰化酶抑制剂TSA可以有效地恢复EZH2介导的DAB2IP下调。3)利用蛋白质免疫共沉淀技术检测发现EZH2、HDAC1/HDAC2、Snail之间存在相互结合。4)干扰Snail能有效抑制EZH2所致的DAB2IP下调。分别干扰Snail和HDAC1/HDAC2能有效逆转EZH2对DAB2IP启动子活性的抑制作用(t=11.565,P=0.000)。5)干扰HDAC1/HDAC2或TSA处理后EZH2与Snail的结合能力下降。6)TSA处理后HDAC1/HDAC2与Snail的结合能力下降,而HDAC1/HDAC2与EZH2的结合能力无影响。7)TSA能有效逆转EZH2对DAB2IP启动子活性的抑制作用(t=22.972,P=0.000)。以上结果显示：EZH2-HDAC1/HDAC2-Snail形成线性复合物相互协同共同抑制DAB2IP的转录。4. Snail和DAB2IP之间形成正反馈环路1)干扰DAB2IP能上调Snail的表达,抑制GSK3β活性,但对PI3K/Akt通路、GSK和β-catenin总量无影响。干扰DAB2IP能明显促进核内Snail和P-catenin的入核。2) DAB2IP沉默促进β-catenin/TCF转录活性而抑制DAB2IP的转录活性(SW480TOP/FOP:F=46.966, P=0.000; SW480DAB2IP-promoter:F=52.169, P=0.000)。3)成功构建SW480和HCT116(SiSnail、SiSnail/SiDAB2IP)稳定细胞株,SiSnail处理组Snail下调DAB2IP上调,而SiSnail/SiDAB2IP处理组能有效逆转Snail、DAB2IP表达。4)SiSnail处理组能上调DAB2IP而下调p-GSK-3β、P-catenin表达。SiSnail/SiDAB2IP、SiSnail+LiCL (GSK-3p抑制剂)、SiSnail+MG132(蛋白酶体抑制剂)处理组有效的恢复了Snail、p-GSK-3β、β-catenin的表达量。5)SiSnail组β-catenin/TCF转录活性明显降低,相反SiSnail/SiDAB2[P. SiSnail+LiCL、SiSnail+MG132处理后有效恢复了β-catenin/TCF的转录活性；SiSnail处理组增强了DAB2IP启动子的转录活性,相反SiSnail/SiDAB2IP、 SiSnail+LiCL、SiSnail+MG132则使DAB2IP转录活性重新下降(SW480TOP/FOP:F=57.994, P=0.000; SW480DAB2IP-promoter:F=52.169, P=0.000)。以上结果显示：DAB2IP沉默不仅通过GSK-3β促进下游分子Snail的表达和β-catenin/TCF的转录活性、抑制DAB2IP转录活性,还能有效逆转上游转录因子Snail沉默所致的Snail表达、Snail泛素化降解、(3-catenin/TCF和DAB2IP转录活性,提示Snail和DAB2IP之间存在正反馈通路。5. DAB2IP对Snail诱导的结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响1)MTT细胞增殖实验、平板克隆实验表明,与对照组细胞比,SiSnail组结直肠细胞体外增殖能力降低。与SiSnail组相比,SiSnail/SiDAB2IP组细胞有效的恢复了体外增殖能力(SW480:F=20.523, P=0.000; HCT116:F=14.610, P=0.000)。2)迁移实验和侵袭实验表明,与对照组相比,SiSnail组细胞体外迁移、侵袭能力降低(SW480:P=0.000; HCT116:P=0.000)。与SiSnail组相比,SiSnail/SiDAB2IP组细胞有效恢复了外迁移侵袭、侵袭能力(SW480：P=0.000；HCTl16：P=0.000)。3) Western blot检测EMT相关分子标志物的表达,结果发现与对照组相比,SiSnail组细胞上皮标志物E-Cadherin表达升高,而间叶标志物Vimentin表达下降。与SiSnail组相比,SiSnail/SiDAB2IP组细胞有效的恢复了E-Cadherin和Vimentin的表达。4)裸鼠皮下成瘤实验与尾静脉肺转移实验表明,与对照组相比,SiSnai组肿瘤细胞皮下成瘤能力和肺转移能力降低。与SiSnail组相比,SiSnail/SiDAB2IP组肿瘤细胞有效的恢复了体皮下成瘤能力和肺转移能力。(SW480:F=20.523, P=0.000; HCT116:F=14.610, P=0.000)。以上结果显示：DAB2IP是Snail诱导结直肠癌细胞生长、增殖、EMT、侵袭和转移所必需的分子。6. DAB2IP结直肠癌组织中的表达与预后价值1) Real-Time PCR结果显示,在20对配对的结直肠癌及癌旁活检组织中,癌组织的DAB2IP的mRNA(F=8.057, P=0.000)水平显著低于癌旁组织。2) Western blot检测结果显示,在8对配对的结直肠癌及癌旁活检组织中,癌组织中Snail的蛋白水平显著高于癌旁组织,而癌组织中DAB2IP的蛋白水平显著低于癌旁组织。通过软件对蛋白表达条带定量并进行统计学分析发现DAB2IP和Snail呈负相关关系(r=-0.503,P=0.047)。3)200例结直肠癌组织免疫组化结果显示,DAB2IP在正常肠粘膜上皮中的表达高于配对的肠癌组织和淋巴结转移灶。统计学分析发现,DAB2IP的表达与患者的年龄(P==0.009)、肿瘤大小(P=0.044)、淋巴结转移(P=0.039)、Dukes分期(P=0.045)及远处转移(P=0.042)具有显著性相关性。Kaplan-Meier法分析5年生存曲线,DAB2IP低表达的结直肠癌患者的5年生存率明显低于DAB2IP高表达的患者(P=0.001),尤其是晚期患者(P=0.022)。单因素和多因素Cox比例风险模型的预后分析显示,DAB2IP的是影响患者预后的一个独立危险因素(P<0.001)。4)120例配对结直肠癌组织免疫组化结果分析,EZH2在正常肠粘膜上皮中的表达明显低于配对的肠癌组织和淋巴结转移灶。DAB2IP的表达与EZH2的表达呈负相关关系(χ2=4.585,P=0.032)。以上结果显示:DAB2IP在结直肠癌中表达丢失,且与结直肠癌患者,尤其是晚期患者的预后相关。在结直肠癌组织中,Snail和DAB2IP、EZH2与DAB2IP表达呈负相关,进一步证实了EZH2-HDAC1/HDAC2-snail线性复合物在结直肠癌演进中的作用。结论1. DAB2IP作为一种抑癌基因,抑制结直肠癌细胞的体外增殖、EMT、侵袭和体内转移能力；2.转录因子Snail可以与DAB2IP的启动子结合,并形成EZH2-HDAC1/HDAC2-snail线性复合物调控DAB2IP的表达；3. Snail/DAB2IP之间形成正反馈环路,促进结直肠癌细胞体外增殖、EMT、侵袭和体内转移能力；4. DAB2IP在结直肠癌组织中表达下调,是影响结直肠癌患者预后的一个独立危险因素,它有可能成为判断结直肠癌患者病程进展及预后的一个新的分子标志物。本研究的创新之处1)阐明Snail/DAB2IP正反馈信号轴在结直肠癌侵袭和转移中的作用新机制；2)为结直肠癌转移的早期预警、病情进展及预后评估提供一个新的靶点。