鲟鱼肝脏铁蛋白分离纯化、结构表征及铁释放动力学初步研究

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铁蛋白是一种广泛存在于生物体内具有调节体内铁代谢平衡的蛋白质。在水产品加工过程中,往往会产生大量的副产物,如肝、胰、肠等,如果将其进行综合利用,将对水产行业有着重要的意义。本研究以西伯利亚鲟鱼肝脏为原料,采用单因素结合响应面法优化鲟鱼肝脏铁蛋白提取条件;并采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析对铁蛋白进行分离纯化;利用Native-PAGE凝胶电泳、SDS-PAGE凝胶电泳、双向电泳、LC-MS/MS和傅里叶变换红外光谱对铁蛋白进行初步结构表征分析;最后对铁蛋白进行铁还原释放动力学分析。结果为水产品加工副产物的综合利用和铁蛋白的基础研究提供了理论指导和技术支持。在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken原理采用响应面分析法,选择料液比、硫酸铵饱和度、pH值为自变量,铁蛋白提取率为响应值设计实验优化提取工艺,得到铁蛋白最佳提取工艺为:料液比1:3.8,硫酸铵饱和度57%,pH 8.12。通过验证试验,铁蛋白的得率为32.95 mg·kg-1,与理论值34 mg·kg-1偏差较小。采用硫酸铵沉淀、DEAE Cellulose 52阴离子交换、Sephacryl S-300凝胶层析对鲟鱼肝脏铁蛋白进行了分离纯化。通过Native-PAGE凝胶电泳、SDS-PAGE凝胶电泳、双向电泳初步鉴定,鲟鱼肝脏铁蛋白的表观分子量约为400 kDa,一共含有2种亚基(L亚基和H亚基),分子量分别为20.5 kDa和21.1 kDa,等电点分别为6.1和6.6。经LC-MS/MS鉴定铁蛋白亚基,并在数据库Unipot中各搜索匹配出9个多肽序列,两种亚基与中华鲟(Acipenser sinensis)肝脏铁蛋白亚基的同源性分别为69%和68%,与银鳕鱼(Anoplopoma fimbria)肝脏铁蛋白亚基的同源性分别为60%和59%,证明纯化得到的为鲟鱼肝脏铁蛋白。经过傅里叶变换红外分析,鲟鱼肝脏铁蛋白各二级结构的百分含量分别为:β-sheet 40.61%,α-helix 35.86%,β-turn 7.12%,random coil 16.41%。以抗坏血酸为还原剂,Ferrozine为亚铁离子螯合剂,探究鲟鱼肝脏铁蛋白在不同的pH值和不同缓冲液体系中铁释放动力学,结果表明在酸性环境下,铁蛋白释放铁的速率明显高于在碱性环境下的释放速率;在Tris-HCl缓冲液中铁释放的速率高于在磷酸盐缓冲液中的释放速率,证明溶液中的H+、OH-和PO43-对铁蛋白释放完整铁核中的铁具有一定的影响。
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