2,5-呋喃二羧酸(FDCA)作为一种重要的生物基平台化合物,已广泛用于生产生物基聚合物、医药及金属-有机框架材料等。FDCA可由生物基平台化合物5-羟甲基糠醛(HMF)氧化制备。目前,FDCA主要由化学法合成,其特点是反应周期短,底物转化率高,但化学催化存在使用金属催化剂以及需要严苛的反应条件等问题。就反应选择性、反应条件温和性及环境友好性而言,生物催化是一种更具应用前景的方法。然而,生物催化氧化HMF合成FDCA仍颇具挑战,因为HMF对生物催化剂具有强烈的毒性和抑制作用,导致生物催化剂的底物耐受性差、催化效率低等问题。最近,本课题组已从Comamonas testosteroni SC1588挖掘出高HMF耐受性且高活性的醛脱氢酶(ALDHs),但该酶仅能催化HMF中醛基的氧化。前人研究表明,HMF/糠醛氧化还原酶(HmfH)能高效催化HMF中伯羟基的氧化,但该酶难以在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现功能表达。鉴于上述情况,本研究首先尝试在E.coli中实现醛脱氢酶和HmfH的共表达,建立了高效、高选择性合成FDCA的生物催化途径;随后,探究了HMF对该重组菌的毒性机制。主要结果如下:1.高效合成FDCA生物催化途径的建立。结果表明,以低拷贝、携带核糖体结合序列RBS11的p ACYCDuet1为质粒,在Trc启动子的控制下,HmfH能在E.coli中实现功能表达。共表达菌株E.coli_VDH1_HmfH催化HMF氧化的最适p H和温度分别为7.0和30°C。在最适反应条件下,该重组菌对HMF的耐受水平约为150 m M。当底物浓度低于150 m M时,FDCA产率达94-98%。产物FDCA对细胞的毒性和抑制作用主要源于其酸性。体系放大到50 m L规模,反应36 h共获得101 m M FDCA;目标产物经酸沉淀和四氢呋喃萃取后,共纯化得到0.7 g FDCA,FDCA时空收率达0.4 g/L h,纯度为99%,产率约为92%。2.HMF对重组菌的毒性机制。研究发现,HMF会对重组E.coli_VDH1_HmfH产生较强的毒性作用,随着细胞在HMF中孵育时间延长,细胞存活率越低。同时使胞内活性氧水平也逐渐升高,细胞膜完整性、醛脱氢酶/FAD依赖型氧化还原酶活性、胞内辅酶NAD~+和NADH水平及ATP含量下降。本研究初步建立了重组菌E.coli_VDH1_HmfH高效合成FDCA的新途径,揭示了HMF对全细胞催化剂的毒性机制。该研究不仅丰富了生物催化生物基平台化合物高值化转化的理论知识,而且为FDCA工业化制备奠定了技术基础。