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目的:前期研究中,我们从Huh7人肝癌细胞系中成功富集培养出肝癌干样细胞,并用相关实验证实其具有肿瘤干细胞(CSCs,cancer stem cells)的生物学特性。此外,我们使用Exiqon micro RNA芯片在肝癌细胞与肝癌干样细胞中筛查出差异的miRNA表达谱。本研究在前期芯片研究基础上筛选可能参与促进Huh7人肝癌细胞干性形成相关差异表达的miRNA,并进一步探讨其对Huh7细胞干性的影响及其潜在分子机制,为肝癌的分子靶向治疗提供研究基础。方法:一、促进Huh7人肝癌细胞干性形成相关差异表达miRNA的筛选及验证1.用非粘附球培养法在Huh7人肝癌细胞系中富集培养肝癌干样细胞;用实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)方法在肝癌干样细胞与肝癌细胞中检测部分miRNA差异表达谱。2.用qPCR方法在肝癌组织与癌旁组织中检测部分miRNA差异表达谱。二、miR-187-3p对Huh7人肝癌细胞干性的影响及其潜在分子机制1.构建miR-187-3p慢病毒表达载体,感染Huh7人肝癌细胞,以获得稳定转染过表达miR-187-3p的Huh7细胞(miR-187-3p组),并设置感染空载体慢病毒的Huh7细胞为阴性对照(negative control group,NC组)和未感染慢病毒的Huh7细胞为空白对照(Blank组);慢病毒感染Huh7细胞72 h后,用倒置荧光显微镜观察三组细胞中绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,e GFP)的表达情况,进一步用qPCR方法检测三组细胞中目的基因miR-187-3p的表达水平。2.用tumorsphere实验检测miR-187-3p对肝癌干样细胞自我更新能力的影响;用qPCR方法检测miR-187-3p对肝癌细胞肿瘤干细胞标志基因表达的影响。3.用CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验、平板克隆实验、transwell实验和划痕实验在体外检测过表达miR-187-3p对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响;用裸鼠成瘤实在体内验检测过表达miR-187-3p对肝癌细胞成瘤能力的影响。4.用生物信息学软件预测miR-187-3p的下游靶基因。结果:一、促进Huh7人肝癌细胞干性形成相关差异表达miRNA的筛选及验证1.我们从Huh7人肝癌细胞系中富集培养出肝癌干样细胞;进一步用qPCR方法检测到miR-187-3p在肝癌干样细胞中的表达水平显著高于肝癌细胞(p<0.05),与前期miRNA差异表达谱的趋势相一致。2.用qPCR方法检测到miR-187-3p在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(p<0.05),与前期miRNA差异表达谱的趋势相一致。二、miR-187-3p对Huh7人肝癌细胞干性的影响及其潜在分子机制1.慢病毒感染Huh7细胞72 h后,倒置荧光显微镜(暗场)观察三组细胞中e GFP表达情况,结果显示:转染了慢病毒载体的miR-187-3p组和NC组中均可见大量绿色荧光,而未转染慢病毒载体的Blank组中未见绿色荧光,提示慢病毒转染成功;进一步用qPCR法检测miR-187-3p的表达情况,结果显示:miR-187-3p组中目的基因miR-187-3p的表达水平显著高于NC组和Blank组(p<0.01),提示miR-187-3p过表达成功。2.tumorsphere实验结果显示:miR-187-3p组形成的肝癌干样细胞球显著大于NC组和Blank组,且miR-187-3p组的细胞球形成率显著高于NC组和Blank组(p<0.01);此外,qPCR结果显示:miR-187-3p组中部分肿瘤干细胞标志基因BMI1、CTNNB1、KLF4、LIN28和PROM1的表达也显著高于NC组和Blank组(p<0.05)。3.CCK-8和平板克隆实验结果显示:miR-187-3p过表达后,Huh7细胞的增殖能力显著增强,miR-187-3p组的克隆形成率显著高于NC组和Blank组(p<0.01);transwell检测细胞侵袭能力结果显示:miR-187-3p组的侵袭细胞数较NC组和Blank组显著增多(p<0.01);transwell实验和划痕实验检测细胞迁移能力结果显示:miR-187-3p过表达后,Huh7细胞的迁移能力显著增强,miR-187-3p组的迁移细胞数较NC组和Blank组显著增多(p<0.01),且miR-187-3p组24 h/0 h划痕宽度显著窄于NC组和Blank组(p<0.01);裸鼠成瘤实验结果显示:皮下注射肿瘤细胞40天时,miR-187-3p组形成的瘤体明显大于对照组,将瘤体取出测量其体积和重量结果显示:miR-187-3p组的形成瘤体体积和重量均显著大于NC组和Blank组(p<0.01)。4.通过Target Scan、miRanda等生物信息学软件预测发现:UCHL1可能是miR-187-3p的下游功能靶基因。结论:1.过表达miR-187-3p不仅可促进肝癌干样细胞的自我更新和成球能力,还可促进肝癌细胞部分肿瘤干细胞标志基因的表达。2.过表达miR-187-3p可促进肝癌细胞在体外的增殖、侵袭、迁移及裸鼠体内的成瘤能力;miR-187-3p可能通过靶向作用于UCHL1影响肝癌细胞的生物学功能。