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研究背景糖皮质激素(glucocorticoid, GC)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素,主要为皮质醇(cortisol),具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用,还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。除此之外,糖皮质激素对细胞的一系列生物学过程,如增殖、分化、凋亡等,都有重要的调节作用,这是糖皮质激素应用于恶性肿瘤临床治疗的分子基础。目前有研究表明,糖皮质激素主要通过影响某些细胞通路中的细胞因子或相关蛋白,在膀胱癌肿瘤细胞中导致不同程度的双向调节作用,即一方面诱导细胞生长G1期停滞,另一方面抑制细胞凋亡,但此双向调节作用具体与哪些细胞通路、细胞因子、关键蛋白相关,我们仍不得而知。研究目标从标志性蛋白表达方面探讨糖皮质激素受体双向调节膀胱癌肿瘤细胞的相关原因,为膀胱癌的靶向治疗提供新的可能。第一部分GR和CD133/CD44与膀胱癌的临床病理联系1.1研究内容通过对临床标本与已有膀胱癌细胞株的检测,了解膀胱癌中GR的表达、及其与肿瘤分级、分期、转移、预后的相关性,同时检测干细胞相关蛋白CD133/CD44表达,及其与肿瘤的上述相关性。并对两种相关性进行对比,探讨其中有无关联。1.2实验方法(1)人膀胱癌组织中GR表达及临床病理关系组织检测：在组织芯片中对膀胱癌癌组织、癌旁组织、转移淋巴结行免疫组织化学染色,分析上述组织中GR表达的阳性率、阳性强度的差异,探讨GR变化与膀胱癌TNM分期、分级、术后复发、淋巴结转移、及预后的关系。(2)人膀胱癌组织中CD133/CD44表达及临床病理关系组织检测：在组织芯片中对膀胱癌癌组织、癌旁组织、转移淋巴结行免疫组织化学染色,分析上述组织中CD133/CD44表达的阳性率、阳性强度的差异,探讨此两种干细胞相关蛋白标志物的变化与膀胱癌TNM分期、分级、术后复发、淋巴结转移、及预后的关系。(3)人膀胱癌组织中GR表达与CD133/CD44的关系统计学检验：将两次组织检测的结果进行对照分析,初步探讨GR表达与干细胞相关蛋白表达有无可能关联。1.3实验结果免疫组织化学检测提示,在膀胱组织芯片中,所有的正常膀胱尿路上皮、尿路上皮癌、淋巴结转移癌均100%表达GR、CD133/CD44。1.4小结(1)GR在膀胱癌与正常膀胱尿路上皮中均有100%阳性表达；GR高表达可能提示膀胱癌预后良好。(2) CD133/CD44在膀胱癌与正常膀胱尿路上皮中均有100%阳性表达。第二部分GC/GR通路与膀胱癌于细胞相关蛋白标志物的关系2.1研究内容利用shRNA (short hairpin RNA)基因封闭技术研究GR低表达膀胱癌细胞株与其父系GR高表达膀胱癌细胞株之间在体外培养条件下及其在GC与GR拮抗剂作用后,肿瘤干细胞标志蛋白CD133/CD44的表达差异,探讨GR与干细胞标志蛋白的关系。2.2实验方法(1) GC/GR通路对CD133/CD44表达的影响MACS法纯化收集CD133+/CD44+膀胱癌细胞,流式细胞术检测原始膀胱癌细胞株与GR knock-down细胞株中肿瘤干细胞标志物CD133/CD44表达的差异。(2)GR对Wnt/β-Catenin信号通路的调控功能GR对Wnt/β-Catenin信号通路关键分子表达的影响：westem-blot检测原始膀胱癌细胞株与GR knock-down细胞株中地塞米松(Dexamethasone, DXM)和GR拮抗剂RU486对Wnt/β-Catenin主要成员CD44和其主要下游蛋白AP-1表达的影响。2.3实验结果(1) GC/GR通路影响CD133/CD44表达流式细胞术发现TCC5-SUP细胞株中,原始细胞株与GR knock-down细胞株肿瘤干细胞标志物CD133/CD44表达有明显差异,GR活性与干细胞标志物表达成正相关,但UMUC3细胞株中未能收集到CD133+/CD44+阳性细胞群。(2) GC/GR通路正向调控Wnt/β-Catenin信号通路western-blot发现TCC5-SUP细胞株中,原始膀胱癌细胞株与GR knock-down细胞株中地塞米松(Dexamethasone, DXM)和GR拮抗剂RU486对Wnt/β-Catenin主要成员CD44和其主要下游蛋白AP-1表达的影响无明显差异,但UMUC3细胞株中,原始膀胱癌细胞株与GR knock-down细胞株中地塞米松(Dexamethasone, DXM)和GR拮抗剂RU486对Wnt/β-Catenin主要成员CD44和其主要下游蛋白AP-1表达的影响具有显著差异。2.4小结(1)GC/GR通路激活在体外正向调控肿瘤干细胞标志蛋白CD133/CD44表达；(2) western-blot实验提示DXM可激活Wnt/β-Catenin通路,导致关键蛋白CD44/AP-1表达提高；(3)不同膀胱癌细胞株中GC/GR通路的激活对CD133/CD44/AP-1的表达作用不同,其原因有待于进一步讨论。上述研究结果表明膀胱癌中GC/GR通路激活可正向调控肿瘤干细胞标志蛋白CD133/CD44的表达,其中CD44表达的提高引发其位于Wnt/β-Catenin通路的下游蛋白AP-1表达提高,进而导致Wnt/β-Catenin通路活性提高。