系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种女性多见、临床表现多样、可累及全身多脏器的自身免疫性疾病。免疫调节异常在SLE的发病中起主导作用,其中包括许多免疫细胞的功能异常。近年来世界范围内报道SLE的发病率在（13～39）/10万之间,18岁以上女性发病率高达372/10万。我国患病率约为70/10万,且有逐年增多的趋势。其发病机制尚未完全阐明,可能与遗传、环境、性激素等因素有关。泌乳素（Prolactin,PRL）是一种主要由垂体前叶的嗜酸细胞分泌的、具有300多种独立活性的多肽。它参与了机体多个生理和疾病过程,如炎症反应、自身免疫性疾病、渗透压调节等。其经典作用是调节哺乳动物乳腺、卵巢及男性附属生殖器官的生长和分化过程,促进泌乳。它的具体作用包括:①参与T细胞分化,调节TH1/TH2平衡向TH1方向偏移;②活化蛋白激酶C和鸟氨酸环化酶;③具有促有丝分裂原的作用,诱导淋巴细胞的IL-12受体表达和各种生长因子相关基因的表达;④通过干扰素调节因子促进干扰素γ的表达;⑤刺激自身抗体的产生。Vera-Lastra等研究证实,20%-30%的SLE患者存在轻至中度的高泌乳血症,且与狼疮活动有关,因为高水平泌乳素可刺激机体产生各种自身抗体。一些临床研究报道SLE患者血清PRL水平升高,且与ANA滴度和临床疾病活动性指标呈正相关。红斑狼疮模型小鼠,注射PRL加速狼疮小鼠的死亡,而抑制PRL的合成和分泌,则降低小鼠的死亡率,可以推测PRL在红斑狼疮的发病中起重要作用。Yang等发现PRL可诱导TCR/CD3复合蛋白快速磷酸化,潜在地影响抗原受体功能,参与细胞活化第一信号过程。本课题组前期对PRL在细胞活化第二信号中作用的研究中发现,PRL可上调SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）表面CD154的表达。PRL的胞内信号转导途径是近年来的研究热点,现已证明,PRL与其受体结合形成三聚体导致PRL-R被激活,是PRL产生各种生物作用的必要条件和前提,PRL-R激活后,主要通过两种信号分子家族,即JAK/STAT（主要是STAT5）的信号转导作用,将信息传入细胞核,诱导目标基因的转录和表达,这是作为神经、内分泌和免疫网络中介体的PRL调节免疫功能的基本模式。白细胞介素（Interleukin,IL）-6是由单核细胞、淋巴细胞等分泌的细胞因子,可促进B细胞生长、活化而产生多种自身抗体,在细胞内主要通过JAK/STAT信号传递机制发挥生物学作用,已有研究表明IL-6与SLE的发生发展密切相关,IL-6与SLEDAI呈正相关。那么在SLE中,PRL的胞内JAK/STAT信号转导机制如何?高水平的PRL与IL-6的高表达有无内在的因果联系?JAK/STAT信号通路在二者间是否起纽带作用?目前国内外均未见这方面的研究报道,为此我们对SLE患者中PRL介导的胞内主要信号传导通路JAK/STAT5进行研究,并使用AG490进行干预,明确PRL是否通过该通路诱导PBMC分泌炎性细胞因子IL-6而在SLE发病机制中起重要作用。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈脂类衍生物,相对分子质量为294.3,结构类似酪氨酸,可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位置,而竞争性抑制细胞内JAK的活性,从而抑制其下游的信号分子STAT5的表达,进而抑制与该通路有关的各种炎症因子的产生。本研究拟通过AG490对PRL诱导的胞内JAK/STAT5信号通路干预的研究,进一步明确SLE的发病机制,以期为SLE的生物治疗开辟一条新的治疗途径。目的1.检测SLE患者血清PRL水平,分析其与SLE疾病活动性、临床表现及实验室指标的关系。2.研究PRL（内源性）及重组人PRL（rhPRL）对SLE患者PBMC内主要信号蛋白STAT5表达的影响,探讨其参与SLE发病的机制。3.研究PRL及rhPRL对SLE患者PBMC分泌IL-6的影响,从而探讨PRL介导的胞内信号传导通路JAK/STAT5与IL-6产生的关系。4.通过AG490对JAK/STAT5信号传导通路的干预研究,明确SLE中PRL诱导PBMC分泌IL-6的作用机制,以期为SLE的生物治疗开辟一条新的治疗途径。方法1.应用电化学发光仪检测了40例SLE患者（其中女性36例,男性4例）及20例健康人在清晨、空腹及静息状态下的血清PRL水平。取空腹静脉血3ml,血清泌乳素的检测采用电化学发光仪测定。按试剂盒提供标准,血清PRL水平男性＞15.2ng/ml,女性＞23.3ng/ml定为HPRL。2.将样本分组:40例SLE患者中,HPRL的SLE患者为22例,PRL正常的SLE患者18例,又将其按不同的处理方式各自再分为3组,加上健康对照组一共为7组。分组如下:①HPRL的SLE患者组（N=22）;②HPRL的SLE患者+AG490组（N=22）;③HPRL的SLE患者+AG490+rhPRL组（N=22）;④正常对照+rhPRL组（N=20）;⑤正常PRL的SLE患者组（N=18）;⑥正常PRL的SLE患者+rhPRL组（N=18）;⑦正常PRL的SLE患者+rhPRL+AG490组（N=18）。取六孔板,将细胞和培养液铺于六孔板中,使每孔细胞数量达到1×10⁶/ml。rhPRL的最终浓度为10ng/ml,AG490的最终浓度为10^-6mol/l。3.PBMC分离、培养:按密度梯度离心法分离外周血中的PBMC,步骤如下:（1）在15ml有刻度无菌离心管中,每管加入5mlFicoll淋巴细胞分离液,然后雀嗡乜鼓耐庵芫猜鲅?0ml（包括40例系统性红斑狼疮患者和20例正常对照女性）与等量PBS充分混匀稀释。用巴斯德滴管吸取已稀释的抗凝血10ml沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上（每样本按2管分离）,20℃,2000rpm,水平离心20min。（2）用滴管插到灰白色层,吸取单个核细胞,置于另一离心管内。加入5倍以上体积的PBS,20℃,1500rpm,水平离心10min,洗涤细胞2次,获得研究样品的PBMC。（3）处理后的每组细胞放入37℃、5%CO₂培养箱内培养48h后分别进行ELISA检测和Western blot检测。4.ELISA检测:将培养后的细胞1500rpm,水平离心10min,取上清按IL-6 ELISA试剂盒提供的步骤操作。操作程序总结如下:①加样品和标准品,37℃反应90min。不洗。②加生物素标记抗体,37℃反应60min。0.01M TBS洗涤3次。③加ABC,37℃反应30min。0.01M TBS洗涤5次。④TMB 37℃反应10-15min。⑤加入TMB终止液,用酶标仪450nm读数。5.Western blot检测:将离心沉积的细胞用预冷的PBS洗涤3次,加入预冷的细胞裂解液RIPA 20μl及PMSF 5ul,置0℃裂解10min后吸入EP管中,超声粉碎细胞,4℃离心（1,000×g,30min）。取上清提取总蛋白。待测样品采用BCA比色法进行蛋白定量。按常规方法配制10%SDS-PAGE分离胶和5%积层胶。细胞样品加入到上样缓冲液中,在沸水中煮10分钟。然后每孔加入50μg细胞蛋白样品,置电泳缓冲液中,80v电泳约30 min。待样品进入分离胶后,140v电泳至溴酚蓝指示剂离胶底线约1cm时停止电泳。10v半干式电转膜25min,将蛋白质转移至PVDF膜上。TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭2小时后加入一抗1:1000,37℃孵育1小时或4℃过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗1:500,37℃孵育1小时。洗膜后加发光剂显影,定影,洗片。用凝胶成像分析系统进行灰度扫描,结果以STAT5/β-actin、p-STAT5/β-actin的灰度比值表示。6.统计学处理:所有数据输入SPSS13.0软件包,两组样本均数之间的比较使用两独立样本t检验。多组样本均数之间的比较,当满足方差齐性时,使用单向方差分析和样本均数间的多重比较（LSD方法）。当不满足方差齐性时使用近似F检验（Welch方法）及校正的多重比较方法（Dunnett’s T3）。多个样本率的比较使用x²检验。双变量间的关系使用双变量相关分析及多变量间的关系使用曲线估计。使用Curve Expertl.3绘制拟合曲线并根据曲线拟合的决定系数R²选择最佳曲线拟合方程。以P＜0.05视为有统计学意义,结果中数据以x±SD表示。结果1.SLE患者血清平均PRL水平显著高于正常对照组（t=3.783,P=0.000）,且活动期更为明显（F=17.812,P=0.000）。SLE患者血清PRL水平与SLEDAI呈正相关（r=0.568,P=0.000）。2.HPRL的SLE患者中枢神经系统症状如头痛、癫痫发作、肾损害、抗ds-DNA抗体阳性、皮疹及口腔溃疡的发生率显著高于血清PRL正常者（P＜0.05）,而补体C3、C4下降、发热、血液系统受累及浆膜炎等的发生率则无明显差异。3.①HPRL的SLE患者组PBMC分泌IL-6、总STAT5表达水平及STAT5磷酸化（p-STAT5）程度均显著高于正常PRL的SEE患者组和正常对照组（P＜0.05）。②HPRL的SLE患者组PBMC加入AG490培养后,IL-6、总STAT5及p-STAT5的表达均较前显著降低（P＜0.05）。③HPRL的SLE患者组PBMC加入rhPRL和AG490共同培养后,IL-6、总STAT5及p-STAT5的表达较前均显著降低（P＜0.05）。同时发现HPRL的SLE患者组PBMC加rhPRL和AG490共同培养后IL-6及STAT5表达水平较单独加用AG490时有所增加（P=0.000）。4.①PRL正常的SLE患者组PBMC经rhPRL刺激后,IL-6、总STAT5及p-STAT5的表达水平较前显著增加（P＜0.05）。②与正常对照组相比,经rhPRL刺激后,PRL正常的SLE患者IL-6、总STAT5的表达水平明显增加（P=0.000）,但p-STAT5表达水平无明显差异（P=0.135）。③PRL正常的SLE患者组加入rhPRL和AG490前后,IL-6及总STAT5表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）,但p-STAT5水平无明显改变（P=0.067）。结论1.SLE患者血清PRL增高与其病情活动明显相关,可作为判定SLE疾病活动的指标之一。2.无论是外源性还是内源性PRL均可上调SLE患者PBMC内总STAT5、p-STAT5和IL-6的表达水平,AG490能明显抑制这种调节作用。3.AG490可通过下调总STAT5及p-STAT5的表达水平,而对内源性、外源性PRL诱导的PBMC分泌IL-6有明显抑制作用。提示SLE中,JAK/STAT5信号传导通路在PRL与IL-6二者间起重要的纽带作用。4.PRL正常的SLE患者p-STAT5表达水平与正常对照组无显著差异,即使同时用rhPRL刺激也没有改变这种格局,这进一步证实了PRL是通过JAK/STAT信号转导通路在SLE的发病中起作用。