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[目 的]肿瘤转移是一个多因素作用、多阶段演进的过程,肿瘤细胞与周围微环境中的间质细胞交互对话调控该进程。肿瘤微环境中的成纤维细胞称为癌相关成纤维细胞,其处于活化状态,促进肿瘤的发生发展,然而其内在机制仍未明了。课题组前期研究发现血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）可诱导口腔黏膜成纤维细胞发生活化并分泌趋化因子CCL25。本研究以长链非编码RNA为切入点,探索PDGF-BB诱导成纤维细胞活化的作用和分子过程,并从口腔鳞癌细胞与成纤维细胞“对话”角度诠释间质细胞促进肿瘤演进的分子机制,揭示和证实癌细胞与癌相关成纤维细胞的内在关系,为口腔癌治疗提供新思路以及理论依据。[方 法]1.常规培养正常人口腔黏膜成纤维细胞hOMF、人口腔舌鳞癌细胞CAL-27、TCA8113及TSCCA。Transwell小室行成纤维细胞与口腔癌细胞共培养。2.采用30ng/ml PDGF-BB因子诱导hOMF成纤维细胞活化（Activated Fibroblast,AF）。免疫印迹法检测成纤维细胞活化标志物α-SMA表达和相关信号通路蛋白分子表达;qPCR及ELISA检测活化成纤维细胞CCL25的表达和分泌情况。3.CCK8法检测癌细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测癌细胞凋亡;Transwell和划痕实验检测癌细胞侵袭和迁移;免疫荧光检测癌细胞上皮-间质转化相关蛋白表达。4.Arraystar人类lncRNA芯片杂交检测成纤维细胞活化前后表达lncRNAs和mRNAs表达水平,联合分析筛选相关差异lncRNAs,并行qPCR及蛋白免疫印迹法验证。GO分析对基因进行功能注释和富集评分,明确差异基因与其所富集功能条目的相关性,KEGG分析以推断差异基因所参与信号通路。通过氨基酸序列比对、蛋白同源性分析以及RNA结合蛋白（RNABindingProtein,RBPs）预测lncRNA和靶基因蛋白的功能。放线菌素D实验检测成纤维细胞中LURAP1L mRNA的稳定性。双荧光素酶基因报告及FISH实验分析验证LURAP1L-AS1与LURAP1L在成纤维细胞中的结合情况。5.构建慢病毒质粒转染小干扰RNA敲低成纤维细胞中LURAP1L-AS1（命名为hOMF-siLURAP1L-AS1,对照组细胞命名为hOMF-siNC）,qPCR及蛋白免疫印迹方法检测转染后成纤维细胞中LURAP1L-AS1及LURAP1L的表达水平。6.免疫共沉淀及免疫印迹明确与LURAP1L的互作蛋白以及下游信号通路。[结 果]1.免疫印迹检测PDGF-BB诱导后hOMF细胞中活化标志物α-SMA的表达水平增高,加入其受体PDGFR-β的抑制剂可阻断这一变化（p<0.05）。2.活化的成纤维细胞与口腔癌细胞CAL-27、TCA8113及TSCCA共培养后,可使三种癌细胞中E型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达显著降低,N型钙黏蛋白（N-cadherin）的表达显著上调（p<0.05）。ELISA检测成纤维细胞活化后上清中趋化因子CCL25分泌升高,q-PCR检测显示成纤维细胞CCL25表达水平增加,划痕实验及Transwell实验显示CCL25可促进口腔癌细胞CAL-27侵袭/迁移。3.芯片测序后生物信息学筛选出参与调节口腔黏膜成纤维细胞活化的lncRNA 有 LOC102724467、LURAP1L-AS1、G048372、G054461、G089447、LINC01054、RP1-193H18.2、XLOC002805、RP11-193M21.1、G018999,其中主要参与的信号通路有趋化因子信号通路和NF-κB等信号通路;q-PCR验证PDGF-BB诱导口腔黏膜成纤维细胞后,lncRNA LURAP1L-AS1和LURAP1L表达增加。4.放线菌素D实验显示敲低LURAP1L-AS1后可使成纤维细胞中的LURAP1L mRNA的稳定性下降,双荧光素酶实验确定lncRNA LURAP1L-AS1与 LURAP1L 的 5’UTR 区域结合;FISH 实验显示 lncRNA LURAP1L-AS1和LURAP1L在成纤维细胞中存在共定位。5.敲低LURAP1L-AS1后,成纤维细胞LURAP1L的表达也随之降低;与对照组细胞相比,成纤维细胞经PDGF-BB诱导后LURAP1L-AS1和LURAP1L的表达水平显著增加,而PDGF-BB诱导LURAP1L-AS1干扰稳定成纤维细胞株前后,LURAP1L-AS1和LURAP1L的表达水平没有明显变化（p>0.05）。6.经PDGF-BB诱导后,成纤维细胞IKKα、α-SMA和p-NF-κB表达显著增加,差异有统计学意义（p<0.01）;而干扰LURAP1L-AS1表达后,PDGF-BB诱导成纤维细胞IKKα、α-SMA和p-NF-κB的表达变化不明显（p>0.05）;CO-IP结果显示,LURAP1L与IKKα在成纤维细胞中存在互作。7.CAL-27细胞与活化成纤维细胞共培养后,与对照组相比,增殖水平显著增加,凋亡水平显著减少,细胞迁移水平显著增加（p<0.05）;而CAL-27细胞与经PDGF-BB诱导的hOMF-siLURAP1L-AS1细胞共培养时,以上效应减弱。8.与 hOMF-siNC 细胞相比,hOMF-siRURAP1L-AS1 细胞经 PDGF-BB 诱导后CCL25分泌明显降低（p<0.05）。在与CAL-27共培养模型中,经PDGF-BB诱导的hOMF-siLURAP1L-AS1细胞较经PDGF-BB诱导的hOMF-siNC细胞低分泌CCL25。免疫荧光结果显示,活化成纤维细胞与CAL-27细胞共培养,可使CAL-27细胞中occludin和N-cadherin的表达水平显著增加,E-cadherin的表达水平显著减少,经PDGF-BB诱导的hOMF-siLURAP1L-AS1细胞与CAL-27共培养该效应减弱。9.对比单独培养的hOMF细胞,与CAL-27共培养的hOMF细胞和PDGF-BB诱导的hOMF细胞中p-IKKα和p-NF-κB表达均显著增加,而干扰LURAP1L-AS1的表达后可以减弱这一效应。[结 论]1.PDGF-BB通过与口腔黏膜成纤维细胞上的受体PDGFR-β结合,诱导成纤维细胞活化,分泌趋化因子CCL25,促进口腔鳞癌细胞侵袭和迁移2.LncRNA LURAP1L-AS1在PDGF-BB诱导口腔黏膜成纤维细胞活化过程发挥关键作用,其可能通过稳定成纤维细胞中的LURAP1L mRNA,促进LURAP1L蛋白表达,从而增强与IKKα相互作用进而激活NF-κB信号传导途径,诱导趋化因子表达分泌反哺口腔癌细胞。