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机体对肿瘤的免疫应答主要由T淋巴细胞介导，后者的活化和增殖需两个信号：由TCR介导的抗原特异性第一信号和由共刺激分子介导的非抗原特异性的第二信号。缺乏共刺激信号的刺激可导致T细胞免疫耐受或引起活化诱导的T细胞死亡。 膀胱内灌注野生型BCG在预防膀胱肿瘤复发，治疗原位癌和术后残存瘤的临床的首选方案。但仍有部分病人对其治疗无反应，而且野生型BCG可能产生严重的毒副反应。 因此研究与设计一种新型膀胱腔内预防与治疗专用BCG成为热点，本研究结合了BCG和共刺激分子两者在膀胱癌免疫治疗中的优势：(1)BCG：增强肿瘤细胞免疫原性，引诱淋巴细胞等免疫细胞，产生细胞因子。(2)共刺激分子B7：提供共刺激信号，激活淋巴细胞、NK细胞，杀伤肿瘤细胞。这样重组的治疗用BCG疫苗可以加强第一信号，并同时提供共刺激信号，双重作用可以达到降低BCG用量而减少毒副作用，并能明显提高治疗效果的目的。目前国际国内有将其它细胞因子的基因转入BCG的研究，但无采用共刺激分子形成双重刺激信号进行治疗的BCG菌苗。 因此基于上述理论，我们应用基因工程技术构建了一种表达人共刺激分子B7-2的大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，用电穿孔法将重组质粒转化BCG，并鉴定了共刺激分子B7-2在BCG的表达情况、免疫学活性和抗肿瘤作用。过程如下： 一、人B7-2(CD86)表达载体pYL-hB7-2(IgC+IgV)穿梭质粒的构建 方法 用含有BamHⅠ酶切位点和起始密码子的上游引物和含有XhoⅠ酶切位点和终止密码子的下游引物，以含有hB7-2(IgC+IgV)cDNA的质粒为模板进行PCR反应，PCR产物电泳后在690bp左右可见一条带。然后将PCR产物纯化，利用BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切反应，将酶切产物进行电泳，切胶回收 天津医科大学博士学位论文690bp左右的DNA片段，即为具有粘性末端的hB7-2Ogc+I gV)cpNA。将pYL质粒同样利用B田叮Hl、Xhol进行双酶切反应后电泳，在约5000bP左右处出现一条带，切胶回收即为具有粘性末端的空pYL质粒片段。上述两个片段连接形成pYL.hB7一2(Igc+I gy)质粒。转入感受态E. coli10小时左右，LB固体培养基选择卡那抗性菌落，将这些单克隆菌落扩增并提取重组质粒。重组质粒以BalnHI和x五。I进行双酶切后电泳。利用根据空pYL质粒多克隆位点两端的部分序列设计的一对引物进行PCR反应后电泳出现690bP左右条带，以该对引物进行测序反应。 结果重组质粒以B田叮Hl和X五。1进行双酶切后，电泳出现两条带，分别在690和s000bP处左右;未作酶切的重组质粒则只有s000bP左右的一条条带。PCR和测序证明该质粒含有hB7一2(I gC+IgV)c DNA序列，且与gene bank上序列完全相同，成功构建人B7一2(cD86)穿梭表达载体pYL.hB7一ZOgC+IgV)。二、分泌人B7-2(CD86)的重组BCG菌株的建立 方法将对数生长期的野生型BCG制成感受态后，与上述已纯化的重组pYL一hB7一2(lgC+I gV)质粒混合电转。4周左右在含有卡那抗性的7H10培养皿内开始出现少量散在的乳白色菌落，进行挑菌在卡那抗性的7H9液体培养基中扩增。菌体洗涤后煮沸10分钟作为模板。以根据hB7一2(IgC+I gV)序列和pYL质粒MCS两端序列设计的二对引物PCR后切胶回收测序。 野生型BCG与重组BCG形态及生长曲线未见明显差异，对其稀释后记数。利用SDS一队GE和ELISA法测定IOD重组BCG上清液中和超声破碎菌内比7一ZOgC+Igv)，重组BcG连续传十代后再次测定。 结果以菌体模板进行的两次PCR可出现相应条带，测序含有hB7一2(IgC+I gV沁DNA。IOD值野生型和重组型BCG菌液中含有活菌数分别为2.8x lo7eFu和2.7xlo7eFu。一oD重组BeG上清液中研7一2(Ige+19哟含量平均为3.8U/ml，菌内为10.SU/ml，且表达稳定，连续传十代后无明显区别。SDS一PAGE可见29KD大小的蛋白条带含量增加。三、T淋巴细胞增殖实验 天津医科大学博士学位论文 方法从健康人外周血分离培养T淋巴细胞用于实验。实验对象分为四组:①:T淋巴细胞;②:野生型BCG组;③:重组BCG组:④:叨ti一CD86抗体阻断组。将T淋巴细胞加入96孔细胞培养板，并加入上述相应组分，在37℃、5%COZ温箱及饱和湿度条件下培养。用野生型BCG模拟T细胞活化的第一信号，并用进行抗体阻断试验。分别于接种后6hr和72hr用MTT法检测。 结果经野生型BCG刺激培养的淋巴细胞，于培养6一72hr不断增殖 (1 .202一2.332);表达的目的蛋白B7一2分子作为第二信号协同刺激T淋巴细胞后，较野生型BCG的增殖更加明显(l .618一3.109)。在抗体阻断实验中，特异性抗人B7一2单克隆抗体明显抑制目的蛋白的促增殖作用。四、BCG对外周血单核细胞产生INF一Q的影响 方法取上述淋巴细胞增殖实验第②组(野生型BCG上清液)和第③组(重组BCG上清液)同样方法经72小时培养后的外周血单核细胞，用IFN一a的ELISA试剂盒按说明进行测定。 结果ELISA测定表明野生BCG刺激后的外周血单核细胞分泌IFN一Q为40.4n留nil;增加共刺激分子的外周血单核细胞细胞分泌的增加到51 .sng/ml。五、重组BCG激活的淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤实验 方法效应